Рыбакин артур: Сайт пластического хирурга Артура Владимировича Рыбакина

Содержание

Сайт пластического хирурга Артура Владимировича Рыбакина

Рыбакин Артур Владимирович (род. 24 июня 1971 года, Владикавказ, СОАССР) — российский пластический хирург, научный деятель, основатель и главный врач института красоты ГАЛАКТИКА. Основные работы в сфере пластической хирургии, генной и тканевой инженерии.

В 1988 г. окончил среднюю школу №4 в городе Сухуми, Абхазская АСССР

В 1988-1994 гг. обучался в Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. академика Павлова (СПГМУ), лечебный факультет.

В 1994-1996 гг. клиническая ординатура кафедры челюстно-лицевой хирургии СПГМУ, им. И.П. Павлова.

В 1996-1998 гг. аспирантура на кафедре челюстно-лицевой хирургии СПГМУ, им. И.П. Павлова.

В 1997-2001 гг. заведующий отделением пластической хирургии государственного учреждения «Косметологической поликлиники №84» (Санкт-Петербургский Институт Красоты)

В 2001-2016 гг. главный врач ООО «Санкт-Петербургский Институт Красоты», основал клинику совместно с Несватовой Валентиной Михайловной.

С 2016 по настоящее время главный врач клиники ГАЛАКТИКА институт красоты.

C 2016 года по настоящее время директор негосударственного образовательного частного учреждения дополнительного профессионального образования «Институт пластической хирургии и косметологии»

Научная деятельность

В 1999 г. выполнил первую эндоскопическую пластическую операцию в области молочных желез в России

В 2000 г. выполнил первую эндоскопическую пластическую операцию с использованием виртуальных шлемов в России

В 2004 г. разработал метод омоложения тканей с помощью клонированных теломерных последовательностей

В 2010 г. первый научный доклад на конференции по пластической хирургии с использованием 3D визуализации

В 2014 г. выполнил первую в мире робот-асистированную эстетическую пластическую операцию (омоложение верхней трети лица), с использованием робот-асистированной хирургической системы «Da Vinci»

C 2014 г. работы в области тканевой инженерии (размножение клеток хрящевой ткани)

Пластический хирург — Рыбакин Артур Владимирович

В 1988 г. окончил среднюю школу №4 в городе Сухуми, Абхазская АСССР

В 1994-1996 гг. клиническая ординатура кафедры челюстно-лицевой хирургии СПГМУ, им. И.П. Павлова.

В 1996-1998 гг. аспирантура на кафедре челюстно-лицевой хирургии СПГМУ, им. И.П. Павлова.

С 2016 по настоящее время главный врач клиники ГАЛАКТИКА институт красоты.

Научная деятельность

В 1999 г. выполнил первую эндоскопическую пластическую операцию в области молочных желез в России

В 2000 г. выполнил первую эндоскопическую пластическую операцию с использованием виртуальных шлемов в России

В 2004 г. разработал метод омоложения тканей с помощью клонированных теломерных последовательностей

В 2010 г. первый научный доклад на конференции по пластической хирургии с использованием 3D визуализации

C 2014 г. работы в области тканевой инженерии (размножение клеток хрящевой ткани)

Артур Рыбакин — биография и семья

«Звёздный» доктор рассказал всю правду о пластической хирургии

Среди его пациентов Алла Пугачева, Кристина Орбакайте, Авраам Руссо, Анна Самохина, участники «Фабрики звёзд» и еще множество знаменитостей. Молодые и не очень — все звёзды хотят быть красивыми.

К хирургу Артуру Рыбакину именитые пациенты записываются в очередь, притом что он делает по 2-3 операции ежедневно. Точнее будет сказать — еженочно. Рыбакин оперирует только ночью, после получночи. И не скрывает, что многие красавицы и красавцы, которые смотрят на нас с экранов — его пациенты.

Ночью лучше, чем утром

— Артур Владимирович, вы как пластический хирург часто видите своих пациентов среди звезд? Или всё-таки естественная красота побеждает?

— Могу сказать, что ежедневно на обложках журналов вижу как минимум пару-тройку наших пациентов. И это только наших. Многие скрывают, что обращаются к пластическому хирургу — в основном, это политики.

— Почему вы оперируете ночью? Обычно хирурги начинают работать ранним утром.

— Я постепенно перешёл на это время суток за годы хирургической практики. Ночью более спокойно, никто не мешает — пациенты не одолевают вопросами, повседневные дела не отвлекают. Потом оказалось, кстати, что и в Голливуде многие хирурги оперируют ночью. Для пациентов это тоже выгодно — наркоз имитирует сон. Вы весь день не теряете, не нарушаются биоритмы. А если утром человек приезжает, его оперируют, потом он спит, вечером просыпается и ночью приходится давать снотворное. Для организма это стресс.

— К вам часто приходят люди с фотографиями знаменитостей и просьбой сделать «точно такой нос» или разрез глаз? Это вообще возможно?

— Часто. В основном, когда хотят изменить нос. Мы всегда просим пациента принести 5 фотографий с носом, который нравится и 5 — с носом, который не нравится. Точно такой же сделать невозможно. Но можно стремиться к похожей форме. Нельзя примерить на себя чужую внешность. Могу сказать, какой нос в списке самых непопулярных — как у индийской актрисы Ашварайи Рай (см. ФОТО). Её фото женщины чаще всего приносят, как нежелательный пример.

Главное — это зубы!

— До какой степени можно омолодить пациента? Можно ли из 40-летней женщины сделать 20-летнюю девочку?

— Это зависит от того, в каком состоянии изначально находится пациентка, какая у нее кожа. Бывают такие, из которых в 40 лет дай бог сделать 40-летнюю. А бывает, что женщина будет выглядеть если не на 20, то на 10-15 лет моложе точно. Очень важно, курит человек или нет — курение первый враг кожи, загар — второй. И очень важно состояние зубов. Если человек теряет зубы, нарушается весь зубной ряд. Это сразу сказывается на внешности — появляются своеобразные черты лица. Ведь именно акт жевания создал наше лицо таким, каким мы его видим. Поэтому следите за зубами, не допускайте их потери. Многие говорят — вот нет зуба, ничего, займусь этим потом. Это неправильно. Если уж так случилось — как можно скорее ставьте имплантант.

— Есть какая-то часть тела, которую не в силах изменить пластическая хирургия?

— Думаю, что изменить можно любую часть тела. Вопрос только в том, насколько будет заметно хирургическое вмешательство. Легче всего его скрыть на лице — в носу, за ушами, в волосах и т. д. Следы операций на молочных железах можно скрыть под мышками. Чем ниже на теле было вмешательство, тем сложнее идёт рубцевание — придется как-то ограничивать себя в одежде.

— В книгах преступники часто полностью меняют внешность. Это из области фантастики?

— Хотя это и звучит фантастически, это возможно, и такие предложения поступали неоднократно.

— А можно ли сделать «пластику» так, чтобы даже специалист не заметил?

— В принципе, да, но хороший специалист в 90% случаев заметит, что было вмешательство. Идеальная пластическая операция выглядит так: результат заметен пациенту, а все окружающие думают: ты похорошел, что-то в тебе изменилось, но не могут понять, что именно.

В США не экспериментируют, а у нас — да

— Есть две категории людей — одни считают, что «пластика» — это как сходить на прием к терапевту: поправил нос, подрезал подбородок, накачал грудь. Вторая часть считает, что это очень опасные травматичные операции, и в погоне за красотой люди теряют здоровье.

— В основном летальные осложнения связаны с наркозом, но анестезиолог остается в тени, и все шишки падают на пластического хирурга. В некоторых передачах про пластическую хирургию показывают кровь и страдания, а ведь это одни из самых бескровных операций — все делается через маленькие проколы, разрезы. И уже нет тех имплантов, которые разрываются в груди — это прошлый век и страшилки. Чтобы его порвать, нужен такой удар, после которого человек не выживет.

— А как же быть с армией пациентов, которые после пластической операции остаются недовольными?

— Такое тоже бывает. Однако часто люди не видят результата, например, после некоторых видов омоложения, действие которых проявляется в течение полугода — постепенно кожа подтягивается, разглаживается. Но человек себя видит каждый день и не замечает изменений. Приходится показывать фотографии «до» и «после». После чего в ответ мы слышим: «Ой, а разве я такой была?» Бывают и отеки, которые держатся по полгода. Хотя, конечно, тут многое зависит от клиники и квалификации хирурга.

Был у нас такой случай. Пришла девушка с не очень привлекательным носом. После операции у неё получился очень красивый нос — с небольшим прогибом. Через какое-то время она пришла и сказала, что хочет прямой нос. Очень долго с ней совещались, стоит ли менять — ведь нос получился удачный. В итоге она настояла на своём. Как правило, если человеку не нравится результат, то повторную операцию у нас делают бесплатно. Через некоторое время она пришла и сказала — я ошиблась, давайте вернём первый нос. Мы ей объяснили, что это уже третья операция. В итоге мы пошли на третью операцию — снова сделали нос с прогибом. Самое интересное и несмешное то, что через некоторое время она захотела снова прямой нос… Так что пациенты у нас бывают разные.

— Периодически раздуваются скандалы: у нас в России делают операции или используют технологии, которые на Западе запрещены…

— Я бы не сказал. В США, например, просто не экспериментируют. Там делается много операций, но у них жесткие ограничения по методам — хирургу в страховке чётко прописывается, что он должен делать. И если пациенту что-то не понравится, он общается с юристом, а не с хирургом, поэтому новые методы пробовать невыгодно: в случае неудачи хирургу придется выплачивать деньги из своего кармана. У нас же хирурги имеют возможность экспериментировать в хорошем смысле этого слова, то есть сделать операцию так, как будет лучше в данном случае для данного пациента. Хотя большинство методик мы перенимаем за рубежом — в США и Бразилии, где качество вытекает из количества (в этой стране оперируется очень много людей). Соответственно, и хирурги имеют много опыта.

Наша проблема в том, что пластических хирургов в нашей стране не готовят — есть какие-то курсы, но не более того. Сейчас такой специальности у нас нет. В основном поток идёт из челюстно-лицевой хирургии, специалистов-лоров и общих хирургов.

Чем естественнее, тем лучше

— Как вы относитесь к различным ТВ-шоу, где из дурнушек штампуют красоток?

— Это бизнес-проекты, чтобы раскрутить пластическую хирургию. Нам они выгодны. Но не так всё просто — прийти и сделать операцию. Телевизионщики показывают только часть того, что на самом деле происходит. Люди не видят этого тяжелого труда и пациента, и врача. И часто участников в эти шоу набирают непрофессионалы. Поэтому, когда наша клиника участвовала в подобном проекте, мы многих «отсеяли» еще до того, как началась программа. Ну нельзя из человека с весом 200 кг сделать стройного.

— А вы сами поклонник натуральной женской красоты или «улучшенной»?

— Если человек сделал операцию по показаниям, то есть исправил некрасивый нос, уши или увеличил плоскую грудь и при этом выглядит естественно, ему и окружающим нравится — ничего против не имею. В остальных случаях приятно смотреть на естественную красоту. Но если это необъятная грудь или губы на пол-лица, если человек не может остановиться и без конца переделывает свою внешность, улучшая ее, — это уже патология.

— Вы кому-то отказываете в пластической операции или главный критерий в этой индустрии — толщина кошелька?

— Примерно четверть наших пациентов уходит с отказом. Как правило, это происходит, если операция совершенно не показана — когда человек непонятно к чему стремится. Есть те, кто не проходит по состоянию здоровья.

Некоторые люди неправильно себя оценивают — находят изъяны, которые видят только они, какие-то миллиметры. Но человек вбивает себе в голову, что ему нужно изменить внешность. Если пациент после операции заметит изменения, вопрос снимается. Но, как правило, он не замечает результата. Если пластический хирург проморгал такого, потом приходится переделывать операции по несколько раз.

— Не лучше ли в таком случае отправить человека к психологу?

— У нас был опыт работы с психологом, но люди в России не приучены с ним общаться. И если их отправляют к этому специалисту, начинают возмущаться — что я псих, что ли? Поэтому пластический хирург на консультации — и психолог тоже. Он должен увидеть, действительно ли человеку нужна операция или она ему не поможет полюбить себя.

В моде клыки

— Какие самые необычные просьбы вам приходилось выслушивать?

— До сих пор приходят пациенты с просьбой сделать уши, как у эльфа — бум начался, когда появился фильм «Властелин колец». Во все времена наших стоматологов просят сделать клыки, как у вампиров. И если это еще возможно, то в случае с ушами мы предлагаем купить накладки и носить их, а не экспериментировать.

Также в мировой пластической хирургии пациенты часто просят из монголоида сделать европеоида — изменить разрез глаз, скулы, нос и т. д. Особенно «страдают» этим японцы. Люди негроидной расы просят добиться того же. Думаю, это повсеместное влияние Голливуда: его фильмы, популярные во всем мире, пропагандируют героев, как правило, европеоидного происхождения. Если бы Голливуд находился в Японии, пациенты мечтали бы об азиатском разрезе глаз.

— Для многих операция — не прихоть, а возможность вернуться к нормальной жизни, например, после аварии. Как правильно выбрать пластического хирурга?

— Наилучший вариант — рекомендация знакомых, которые уже оперировались у хирурга. Другой вариант поиска, как ни странно, интернет. Хотя нужно честно сказать, что 90% сайтов ангажированы. Остальные действительно созданы фанатами, которые не хвалят одного хирурга или клинику. Есть сайты, где всех хирургов поливают грязью. Нормальный сайт имеет несколько сотен отзывов. Одному администратору сложно от разных имен написать сотни сообщений. Так что чем больше мнений, тем лучше. Есть и тематические сайты: скажем, для тех, кто сделал носы или молочные железы. Посетители таких сайтов периодически собираются на встречи и демонстрируют друг другу результаты — и удачные, и неудачные. Правда, где они показывают друг другу, например, молочные железы — загадка, но тем не менее. На такие встречи приходят и новички, чтобы посмотреть, обсудить с очевидцами хирурга и клинику.

Самые популярные пластические операции в России:

Женшины

* Ринопластика (изменение формы носа)

* Изменение формы молочных желез

* Липосакция (избавление от лишнего жира)

* Омоложение

* Блефаропластика (коррекция формы век)

Мужчины

* Ринопластика

* Липосакция

* Омоложение

* Изменение формы ушей

* Блефаропластика

Страны-лидеры по количеству пластических операций

* США

* Бразилия

* Франция

Факт

Стоимость любой пластической операции, будь то ринопластика или липосакция, в известных клиниках — от 5 до 15 тыс. у.е.

Специалисты | galaktika.clinic

Первый в мире

В марте 2014 года Артур Владимирович стал первым пластическим хирургом планеты, который провел омолаживающую операцию с применением робот-ассистированного комплекса Да Винчи. Операция, направленная на омоложение лица, длилась два с половиной часа, и уже на следующий день счастливая пациентка была выписана из клиники.

Трудно переоценить значение этого события для мировой эстетической хирургии. Производитель не комплектует робот Да Винчи специальным набором инструментов для пластических операций. Другими словами, подобные операции изначально не рассматривались в качестве сферы применения роботизированного хирургического оборудования.

Команде хирургов под руководством Артура Владимировича удалось преодолеть технические трудности и открыть в истории пластической хирургии принципиально новую страницу. Артур Владимирович продемонстрировал миру, что робот-ассистированная эстетическая коррекция возможна, и она дает прекрасные результаты. Итоги озвучены в докладе «Робот-ассистированные технологии в пластической и эстетической хирургии».
Рыбакин Артур Владимирович
— российский пластический хирург, научный деятель, основатель и главный врач института красоты ГАЛАКТИКА. Основные работы в сфере пластической хирургии, генной и тканевой инженерии.

1988-1994 гг. — Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика Павлова (СПГМУ), лечебный факультет.

1994-1996 гг. — клиническая ординатура кафедры челюстно-лицевой хирургии СПГМУ, им. И.П. Павлова.

1996-1998 гг. — аспирантура на кафедре челюстно-лицевой хирургии СПГМУ, им. И.П. Павлова.

1997-2001 гг. — заведующий отделением пластической хирургии государственного учреждения «Косметологической поликлиники №84» (Санкт-Петербургский Институт Красоты)

2001-2016 гг. — главный врач ООО «Санкт-Петербургский Институт Красоты», основал клинику совместно с Несватовой Валентиной Михайловной.

С 2016 года по настоящее время главный врач клиники ГАЛАКТИКА институт красоты.

C 2016 года по настоящее время директор негосударственного образовательного частного учреждения дополнительного профессионального образования «Институт пластической хирургии и косметологии»

Научная деятельность

В 1999 г. выполнил первую эндоскопическую пластическую операцию в области молочных желез в России

В 2000 г. выполнил первую эндоскопическую пластическую операцию с использованием виртуальных шлемов в России

В 2004 г. разработал метод омоложения тканей с помощью клонированных теломерных последовательностей

В 2010 г. первый научный доклад на конференции по пластической хирургии с использованием 3D визуализации

В 2014 г. выполнил первую в мире робот-асистированную эстетическую пластическую операцию (омоложение верхней трети лица), с использованием робот-асистированной хирургической системы «Da Vinci»

C 2014 г. работы в области тканевой инженерии (размножение клеток хрящевой ткани)

Периорбитопластика — новое слово в пластической хирургии

По мнению Артура Владимировича, развитие хирургии уже привело к переосмыслению концепции омоложения и эстетической коррекции. Передовые технологии открывают новые горизонты, заставляют пересматривать фундаментальные правила, усложнять задачи и ставить более высокие цели. Итогом эволюционного развития парадигмы улучшения эстетики лица и тела становится появление новых пластических операций.

Периорбитопластика — новейшее направление пластической хирургии лица. Раньше арсенал хирургов был ограничен блефаропластикой и коррекцией азиатского разреза глаз. Сегодня такой подход к омоложению периорбитальной области считается устаревшим. Эстетическое восприятие лица зависит от многих факторов: высоты наружного угла глаза, ширины и наклона глазной щели, положения складки верхнего века, контуров скуловой области.

Артур Владимирович настаивает на необходимости использовать комплексный подход к омоложению периорбитальной зоны. С помощью операций, которые выполняются в рамках периорбитопластики, он моделирует каждый из перечисленных выше параметров и добивается улучшения внешности, о котором при использовании старых методик не могло быть и речи.

Изменилась и концепция омоложения лица. Возрастные процессы затрагивают кожно-жировые и мышечно-апоневротические структуры. Главной задачей пластического хирурга Артур Владимирович видит исправление дефектов на уровне глубоких тканей, которое стало возможным благодаря развитию эндоскопического оборудования и внедрению технологий тканевой инженерии.

Развитие эндоскопической техники позволило отказаться от длинных разрезов и проводить операции, не оставляющие видимых рубцов. Артур Владимирович обращает внимание на другие, не очевидные для пациента преимущества эндоскопии — уменьшение травмирования тканей, снижение кровопотери, сокращение восстановительного периода.

Тканевая инженерия в пластической хирургии

Внедрение технологий тканевой инженерии расширяет горизонты омолаживающей коррекции при решении проблемы дефицита тканей, сформировавшегося на фоне возрастных изменений. Для восполнения дефицита объема и моделирования черт лица Артур Владимирович использует пересадку жировой или хрящевой ткани пациента — естественного и безопасного трансплантационного материала.

Методы тканевой инженерии Артур Владимирович использует в ринопластике, малярпластике, гениопластике. Он убежден, что уже сегодня эстетические хирурги должны интегрировать технологии тканевой инженерии в повседневную клиническую практику. Справедливость своих убеждений Артур Владимирович доказывает результатами пластических операций.

Аутолипотрансплантацию, или липофилинг, доктор активно использует в маммопластике. Моделирование формы и омоложение молочных желез путем пересадки жировой ткани лишено недостатков, присущих силиконовым имплантам. Нет риска капсулярной контрактуры, поворота или смещения импланта. Жировая ткань безопасна, и она позволяет гибко моделировать форму груди, добавляя объем там, где это необходимо. Операция проводится без разрезов, реабилитационный период отсутствует, шрамов не остается.

Факты из биографии

Факты из биографии Артура Владимировича известны не только коллегам и поклонникам его таланта, но и людям, интересующимся пластической хирургией. Медицинское образование получил в СПГМУ имени академика И.П. Павлова. С 1997 года работал заведующим отделением пластической хирургии Санкт-Петербургской «Косметологической поликлиники №84», которая впоследствии была реорганизована в Санкт-Петербургский Институт Красоты СПИК.

С 2001 года является главным врачом и руководителем Института Красоты. Ведет научную и практическую деятельность. Регулярно выступает с докладами на всероссийских и международных конференциях, посвященных вопросам эстетической и реконструктивной хирургии.

Оперирует и принимает пациентов в Санкт-Петербурге и Москве, в клинике эстетической медицины Галактика. Чтобы записаться на прием Артура Владимировича, вам необходимо связаться с администратором клиники.

Рыбакин Артур Владимирович > 1 в рейтинге > отзывы

Артур Владимирович Рыбакин входит в авангард пластических хирургов Санкт-Петербурга. За 25 лет успешной работы он успел стать доктором медицинских наук, а также одним из самых знаменитых специалистов в России, поскольку оперировал многих звезд отечественного шоу-бизнеса.

Артур Рыбакин — выпускник Санкт-Петербургского Государственного Медицинского Университета имени академика И.П. Павлова. Далее последовала ординатура в альма-матер, а после и аспирантура.

Любимой операцией хирург называет ринопластику, однако его мастерство и навыки позволяют ему успешно проводить любые омолаживающие операции на лице, маммопластику, подтяжку живота, отопластику, липосакции и липофилинг, коррекцию подбородка и голеней, женскую интимную пластику.

Пластический хирург активно повышал свою квалификацию благодаря участию в симпозиумах, конференциях, мастер-классах. Специалист активно занимается и научной деятельностью. Благодаря этому во многих направлениях эстетической хирургии доктор Рыбакин становился первооткрывателем. Так, в 1999 году он выполнил первую эндоскопическую пластическую операцию в области молочных желез в России, затем последовала первая эндоскопическая пластическая операция с использованием виртуальных шлемов в России. Артур Владимирович также разработал метод омоложения тканей с помощью клонированных теломерных последовательностей, а позже представил первый научный доклад на конференции по пластической хирургии с использованием 3D визуализации.

Особое уважение зарубежных коллег доктор Рыбакин получил после того, как в 2014 году выполнил первую в мире робот-ассистированную эстетическую пластическую операцию (омоложение верхней трети лица), с использованием робот-ассистированной хирургической системы «Da Vinci». С тех пор специалист продолжает свои работы, но уже в области тканевой инженерии (размножение клеток хрящевой ткани).

Артур Рыбакин долгое время (2001-2016) работал главным врачом и пластическим хирургом «Института красоты СПИК». С 2016 по настоящее время специалист принимает пациентов в собственной клинике — Институте красоты «ГАЛАКТИКА», и является директором негосударственного образовательного частного учреждения дополнительного профессионального образования «Институт пластической хирургии и косметологии».

Рыбакин Артур Владимирович: 9 отзывов, где принимает

Я всегда мечтала о красивой и большой груди. У меня была фигура мальчишеская. Груди не было от слова совсем. К работам Артура Владимировича я давно присматривалась, очень нравились. Когда появилась возможность сделать операцию, то я вообще никого кроме него не рассматривала. сразу пошла к нему на консультацию, и при личном общении с ним убедилась окончательно в своем выборе. Я и без того знала, что он профессионал в своем непростом деле, и плюс еще на консультации он это продемонстрировал. На операцию я шла вообще без капли переживаний. У себя в голове я была готова к ней еще за год до фактической даты)) После операции я еще долго не могла поверить в то, что это правда) Что я правда сделала операцию по увеличению груди, и что операцию проводил такой профессиональный хирург, как Артур Владимирович Рыбакин!

От всей души рекомендую Артура Владимировича всем, кто хочет в себе что-то изменить! Я у него делала увеличение груди. Результат просто огонь! Четвертый размер, форма очень красивая, натуральная, аккуратная. Грудь не выглядит вульгарно, она аккуратна и красивая, и естественная, что для меня было очень важно, когда я шла на операцию по увеличению груди. И операция, и реабилитация прошли легко, доктор всегда на связи. Отношение со стороны доктора, и со стороны его помощников просто отличное. Я очень рада тому, что все же смогла попасть в руки Артура Владимировича)

Очень крутой результат операции по увеличению груди получился! Вообще не жалею, что сразу пошла к Артуру Владимировичу, даже не рассматривая других хирургов! Я видела много работ Артура Владимировича и по увеличению груди, и по другим видам операции, мне все его работы очень нравились. И конечно в моем случае он тоже все прекрасно сделал! Очень красивая грудь почти четвертого размера, которая прекрасно гармонирует с моей фигурой в целом! Очень классный результат операции!

Хочу выразить свою благодарность Артуру Владимировичу Рыбакину за прекрасно проведенную операцию по увеличению груди! Я пришла к нему по рекомендации, но к слову, я и сама не мало про него знала и слышала., но все же на выбор хирурга, как мне кажется, сильно влияет тот факт, если кого-то советуют знакомые. На мой выбор это конечно сильно повлияло. При личном знакомстве с Артуром Владимировичем Рыбакиным я убедилась в том, что он действительно профессионал. На операцию к нему я пошла спокойной, уверенная в том, в что он все сделает как нужно. И не ошиблась. Грудь Артур Владимирович сделал очень красивую. И главное, что по виду вообще не скажешь, что это дело рук хирурга, а не природы) Очень хороший результат! Артур Владимирович лучший!

Он конечно профи высшего уровня, но у него такой подход к пациентам, говорят, некоторые пациенты после длительного общения с ним, чуть ли не у психоаналитика потом наблюдаются )) У Рыбакина очень тяжелый характер и как я поняла, он просто ставит условия и на встречу пациентам не идет. Не знаю, может ли себе такое позволять врач, мне кажется нет, каким бы звездным он не был…

30 октября 2012 г.

Рыбакин — признаный, один из лучших в России, если не лучшим считается. Так вот, трое моих знакомых оперировались у него. После консы все как один говорили, что говорит мало, толком непонятно ничего, ясно только что сделает мол хорошо. Все в итоге очень довольны результатом, хотя одной пришлось оперироваться повторно.

30 октября 2012 г.

Рыбакин грешит короткими носами, как у Божены Рынски — мне это не совсем нравится.

24 октября 2010 г.

Я делала пластику носа в СПИКе у Рыбакина, правда 5 лет назад. Тогда он еще не был так раскручен и операция мне обошлась в 1000$. Мне убирали горбинку и делали нос короче, внешних швов не было никаких, только внутренние. Сейчас у меня идеальный носик, я его обожаю.

Рыбакин считается одним из лучших пластических хирургов, он принимает в Москве и Питере и он спец именно по ринопластике.

Рыбакин Артур Владимирович — пластический хирург (Санкт-Петербург), где принимает и отзывы клиентов

Пару месяцев назад сделала у Артура Владимировича Рыбакина риносептопластику. Из-за травмы носа он, нос в смысле, потерял свою прежнюю форму, появилась горбинка, плюс было немного смещение, или искривление, так будет правильнее, перегородки. А это уже в свою очередь повлекло за собой проблемы с дыханием. Они были малозаметны, но все же они были. Выражалось это в том, что дыхание у меня было шумное. Сама я до поры до времени на это внимания не обращала, даже не думала о том, что есть у меня такой вот косячок. А первый, кто указал мне на это, в качестве шутки, был мой молодой человек. Сказал, что порой я дышу так тихо, как паровоз. Я почему-то долгое время сама себя убеждала в том, что все ок. На операцию решилась только после разговора с сестрой, она мне показала работы различных хирургов, отзывы с ней почитали, на форумах тематических позависали, и я решилась на операцию. Было нелегко, но сейчас я понимаю, что оно того определенно стоит! Нелегко мне было решиться, потому что у меня раньше никаких серьезных хирургических вмешательств не было. Поиски и выбор хирурга я так же осуществляла с сестрой. Вместе с ней и на консультации ходили, и с пациентами при возможности общались. И вместе с ней и решили, что кроме Артура Владимировича Рыбакина, никого лучше не найти. По крайней мере, он отвечал всем моим запросам. Классно провел консультацию, информативно, я бы сказала, на все вопросы ответил, все четко, грамотно и доходчиво рассказал. Недельку где-то я подумала, поразмышляла над всем и решила у него сделать операцию. В общем-то, это было правильное решение! Артур Владимирович — мастер своего дела! Блестяще провел операцию. Убрал горбинку, придал моему носу красивую форму, и хоть сейчас еще она не окончательная, но я уже в полнейшем восторге. Нос с прогнутой спинкой и аккуратным кончиком. Также доктор и дыхание мне нормализовал. Сейчас я дышу как обычный нормальный человек. И только когда я впервые вдохнула своим новым носом воздуха, я поняла, чего была лишена долгое время! Артур Владимирович — потрясающий хирург и человек! Я ему очень благодарна за свой новый нос!

Доктор Артур Владимирович Рыбакин

Санкт-Петербургский институт эстетической медицины, Россия

Образование
1988-1994 Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.И.Павлова
1994-1997 Кафедра челюстно-лицевой и пластической хирургии Санкт-Петербургский государственный медицинский университет по специальности Пластическая и челюстно-лицевая хирургия.
1997-2001 Отделение эстетической пластической хирургии Санкт-Петербургского государственного косметологического центра, главный хирург, заведующий отделением.
С 2001 г. Санкт-Петербургский институт красоты,
Главный хирург и заведующий отделением эстетической пластической хирургии, медицинский директор Санкт-Петербургского института красоты

Прошлый доклад
1998 Научно-медицинская конференция Последние достижения эстетической медицины и пластической хирургии. прочитал лекцию Омоложение хирургии лица и шеи (Россия, Санкт-Петербург)

1999 Научно-медицинская конференция Последние достижения эстетической медицины и пластической хирургии, прочитал лекцию «Внедрение эндоскопических методов в эстетической пластической хирургии» (Россия, Санкт-Петербург)

2001 представляет еженедельно Телепрограмма «Лаборатория красоты», посвященная эстетической и пластической хирургии.

РЕФЕРАТ
Интерес к старению кожи в значительной степени является результатом надвигающихся
демографических изменений, связанных со старением поколения бэби-бума. Психосоциальные и
физиологические эффекты старения кожи на пожилых людей создали потребность в
поиске новых стратегий восстановления и омоложения кожи. Последние
работ существенно разъяснили механизмы старения кожи. В частности, в
можно сделать вывод о центральной роли передачи сигналов на основе теломер.
Внутреннее старение в значительной степени контролируется прогрессирующим укорочением теломер,
усугубляется окислительным повреждением теломер и других клеточных компонентов
. Потеря теломерных повторов с делениями клеток также может ограничивать
репликативной продолжительности жизни клеток кожи (кератиноцитов и фибробластов).
Наша стратегия восстановления кожи и омоложения кожи основана на гипотезе
, согласно которой клонированные теломерные повторы, нацеленные на ядро клеток, могут вносить
вклад в механизм деления клеток и долголетие этих клеток.
Последовательности связанных с теломерами повторов будут амплифицированы в реакции полимеразной цепи
(ПЦР), содержащей общую геномную ДНК в качестве матрицы, и клонированы в векторах T-A
. Синтетические пептиды, содержащие сигнал ядерной локализации (NLS), будут связываться с клонированной ДНК
, так что полученный комплекс ДНК-NLS будет
распознаваться как ядерный импортируемый субстрат. Технически этот подход будет протестирован
на культурах клеток, трансплантатах кожи и лабораторных животных с использованием липосом или
пептидных векторов.Мы предполагаем, что наш подход может создать новую историю пролиферации клеток
и предотвратить и обратить вспять большую часть патологии кожи
, связанной со старением.

Роботизированное омоложение верхней части лица

Plast Reconstr Surg Glob Open. 2016 июн; 4 (6): e747.

, MD, ^*, MD, ^†, MD, ^‡, MD, ^*, MD, ^*, MD, ^*, MD, ^* и, MD ^*

Артур В.Рыбакин

Из Института красоты ^* Санкт-Петербурга, Москвы и Санкт-Петербурга, Россия; ^† Частная практика, Москва, Российская Федерация; и ^‡, отделение пластической и реконструктивной хирургии, косметологии и клеточных технологий, Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Российская Федерация.

Боровиков Алексей Михайлович

Из Института красоты Санкт-Петербурга ^*, Москва и Санкт-Петербург, Россия; ^† Частная практика, Москва, Российская Федерация; и ^‡, кафедра пластической и реконструктивной хирургии, косметологии и клеточных технологий, Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Российская Федерация.

Наталья Евгеньевна Мантурова

Из Института красоты ^* Санкт-Петербурга, Москвы и Санкт-Петербурга, Россия; ^† Частная практика, Москва, Российская Федерация; и ^‡, кафедра пластической и реконструктивной хирургии, косметологии и клеточных технологий, Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Российская Федерация.

Гладышев Дмитрий Викторович

Из Института красоты ^* Санкт-Петербурга, Москва и Санкт-Петербург, Россия; ^† Частная практика, Москва, Российская Федерация; и ^‡, кафедра пластической и реконструктивной хирургии, косметологии и клеточных технологий, Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Российская Федерация.

Давид Михайлович Камалов

Из ^* Института красоты Санкт-Петербурга, Москвы и Санкт-Петербурга, Россия; ^† Частная практика, Москва, Российская Федерация; и ^‡, кафедра пластической и реконструктивной хирургии, косметологии и клеточных технологий, Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Российская Федерация.

Щербаков Кирилл Григорьевич

Стайсупов Валерий Юрьевич

Данила Анатольевна Кузин

Автор, ответственный за переписку. Боровиков Алексей Михайлович, доктор медицинских наук, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. Павлова, Санкт-Петербург, Россия, E-mail: ur.xednay @ vokivorobma

Поступило в редакцию 3 сентября 2015 г .; Принято 11 марта 2016 г.

Резюме:

Роботизированные технологии до сих пор не применялись в эстетической хирургии. Авторы изучили осуществимость и потенциальные преимущества роботизированной технологии в хирургии омоложения верхней части лица, а также полезность инструментов, доступных на рынке.Подтяжка лба проведена вместе с блефаропластикой 4 пациентам. На этапе вскрытия использовалась хирургическая система Robotic da Vinci (Intuitive Surgical, Inc.). Использовались стереоэндоскоп 30 градусов, диаметром 12 мм и позже 8,5 мм, и набор инструментов диаметром 8 мм и позже 5 мм. Общие результаты оказались практически такими же, как и после обычной подтяжки бровей с помощью эндоскопа. Преимущества роботизированной хирургии: наилучшее отображение, масштабируемость изображения; отсутствие тремора, масштабируемость амплитуды движений; высокая степень свободы движений, превышающая возможности человека; быстрое и легкое переключение между эндоскопом и любой из 3 манипуляторов; и повышенный комфорт для хирурга.Были отмечены следующие недостатки: стоимость, крутая кривая обучения, отсутствие тактильной обратной связи и отсутствие инструментов, специально приспособленных для эстетической хирургии. Авторы приходят к выводу, что роботы войдут в сферу эстетической пластической хирургии так же, как и эндоскопия, при условии, что инструменты будут адаптированы к конкретным потребностям.

Нашей целью было изучить осуществимость и потенциальные преимущества роботизированных технологий в эстетической хирургии, а также полезность инструментов, доступных на рынке.В качестве модели мы выбрали операцию по омоложению верхней части лица, потому что эндоскопия является общепринятой практикой в этой области.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

С марта 2014 года по апрель 2015 года мы провели роботизированные операции по омоложению верхней части лица 4 пациентам с умеренными возрастными изменениями, все женщины в возрасте от 37 до 45 лет. Подтяжка лба выполнялась вместе с верхней блефаропластикой в каждом случае под эндотрахеальной анестезией; нижняя блефаропластика дополнительно выполнена 2 больным.Все пациенты дали информированное согласие на роботизированную операцию по омоложению верхней части лица.

Плоскость рассечения находилась под височно-теменной фасцией в виске и под надкостницей на лбу с разделением надкостницы на верхнем крае глазницы через 5 портов, как описано Рамиресом. ¹

На лбу делали 3 разреза по 2 см параллельно линии роста волос и 2 височных разреза по 3,5 см каждый. Швы Vicryl (Ethicon, Inc., Somerville, N.J.) 3-0 применяли для укорачивания лобно-теменной части волосистой части головы за счет складок, натяжения и прикрепления височной фасции к височной фасции.Раны закрывали швами Monocryl (Ethicon, Inc.) 4-0 и 5-0. Дренажи не использовались.

На этапе диссекции использовалась хирургическая система da Vinci (Intuitive Surgical, Inc., Саннивейл, Калифорния). ( См. Видео 1, дополнительный цифровой контент 1 , в котором демонстрируется хирургическая установка, роботизированная тележка со стороны пациента с 3 роботизированными руками и командная консоль, на которой сидит хирург. Это видео доступно в разделе «Связанные видео» полнотекстовой статьи на PRSGlobalOpen.com или http://links.lww.com/PRSGO/A202; см. Видео 2, Дополнительный цифровой контент 2 , роботизированное рассечение в реальном времени вокруг сторожевой вены. Это видео доступно в разделе «Связанные видео» полнотекстовой статьи на PRSGlobalOpen.com или на http://links.lww.com/PRSGO/A203.) Операция на веках была проведена традиционными методами.

В двух исходных случаях использовались стереоэндоскоп 30 градусов (диаметр 12 мм) и набор инструментов (диаметр 8 мм) (рис.). В третьем случае стереоэндоскоп 30 градусов, 8.Использовались инструменты диаметром 5 мм и инструменты диаметром 5 мм (изогнутые ножницы, щипцы ДеБейки).

Сменные инструменты, прикрепленные к трем роботизированным манипуляторам: щипцы Tenaculum, стереоэндоскоп диаметром 12 мм и монополярные изогнутые ножницы (Intuitive Surgical Inc., Саннивейл, Калифорния). Также использовались биполярные щипцы Мэриленда и биполярные щипцы с отверстиями.

В четвертом случае использовались стереоэндоскоп 30 градусов, диаметром 8,5 мм и инструменты диаметром 5 мм (изогнутые ножницы) и 8 мм (монополярные изогнутые ножницы, фенестрированные биполярные щипцы).Интенсивность света уменьшили вдвое, чтобы избежать термических повреждений. Для предотвращения контакта линз с тканями использовалась специальная пластиковая насадка для эндоскопа из шприца. Очищенный помощник был необходим для создания входных ран, начальной оптической полости, введения инструментов (рис.) И некоторых заключительных манипуляций.

Ассистент вводит инструменты в подготовленные полости на лбу и висках.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Нам удалось завершить хирургическое омоложение верхней части лица стандартными инструментами da Vinci, поскольку в нашем распоряжении не было специализированных инструментов.Общие результаты оказались практически такими же, как и после обычного подтяжки бровей с помощью эндоскопа ( см. Дополнительный цифровой контент 3, http://links.lww.com/PRSGO/A211 ). Несколько меньший отек мог быть отмечен у оперированных эндоскопом 8,5 мм по сравнению с диаметром 12,0 мм.

Мы подтверждаем следующие преимущества роботизированной хирургии:

Наилучшее отображение: высокое разрешение, трехмерность, масштабируемость изображения;
Отсутствие тремора, масштабируемость амплитуды движения.Высокая степень свободы движений, превышающая человеческие возможности — 7 уровней свободы с диапазоном движений 90 градусов.
Быстрое переключение между эндоскопом и любой из 3 манипуляторов с помощью хирурга или ассистента.
Возможность значительного расстояния между входным портом и хирургической мишенью, позволяющая манипулировать «за горизонтом» выпуклостей.
Безграничное расстояние между пациентом и хирургом.
Повышенный комфорт для хирурга: удобная поза, легкость в обращении, отсутствие чистки агрессивными антисептиками. Все это может ускорить процедуру.

Заодно подтверждаем известные недостатки:

Стоимость
Крутая кривая обучения
Отсутствие тактильной обратной связи, т.е. ощущения сопротивления тканей
Отсутствие специально настроенных инструментов для эстетической хирургии в то время.

ОБСУЖДЕНИЕ

После появления эндоскопической хирургии ее сочетание с эстетической хирургией было лишь вопросом времени и привело к появлению ряда новых подходов и методов. Было много споров об их эффективности и общей ценности. В настоящее время пластические хирурги охотно используют преимущества эндоскопических технологий в увеличивающей маммопластике, ² септоринопластике, ³ и абдоминопластике, ⁴ и т. Д. Более того, эти технологии используются даже в открытых и «полуоткрытых» доступах.

Роботизированные технологии — это прогресс эндоскопии, который приносит беспрецедентные достижения. Как любую новинку, она сложна для восприятия и имеет множество плюсов и минусов. Мы уверены в больших перспективах этого нововведения в эстетической пластической хирургии. Процедуры станут более быстрыми, эффективными и менее травматичными. Продвижение роботизированных методов в хирургию омоложения средней зоны лица и шеи, несомненно, принесет дополнительные значительные преимущества, то есть выполнение минимально инвазивной диссекции на более широких участках и с большей уверенностью и точностью, насколько позволяют улучшенная визуализация и инструментарий.Это облегчит гомеостаз и наложение швов в ограниченном пространстве в любом желаемом месте. Вся область эстетической хирургии значительно выиграет от миниатюризации инструментов и эндоскопов, что может стать настоящим прорывом в ринопластике, например, особенно с развитием технологии «одного участка», ⁵, где требуется только одно отверстие. Роботы войдут в сферу эстетической пластической хирургии так же, как и эндоскопия, при условии, что оборудование будет адаптировано к нашим конкретным потребностям.

Вопрос: «В чем причина использования сверхдорогой технологии, когда косметическая цель может быть достигнута традиционным недорогим способом?» очень уместно. Ответ парадоксальным образом можно найти в общей бесхозяйственности, присущей России. Очень дорогие инструменты, такие как роботы da Vinci, никогда не используются на полную мощность, и можно легко найти способ «поиграть» с новыми машинами (при условии достаточного обучения) без дополнительных затрат для пациента. Все дело в любопытстве хирурга и его стремлении к продвижению.

См. Видео, Дополнительный цифровой контент 1, в котором демонстрируется хирургическая установка: роботизированная тележка рядом с пациентом с 3 роботизированными руками и командная консоль, на которой сидит хирург. Помощник на этом этапе не нужен и удобно смотрит на монитор. Это видео доступно в разделе «Похожие видео» полнотекстовой статьи на PRSGlobalOpen.com или по адресу http://links.lww.com/PRSGO/A202.

См. Видео «Дополнительный цифровой контент 2», в котором в реальном времени показано роботизированное рассечение вокруг сторожевой вены с правой стороны.Это видео доступно в разделе «Похожие видео» полнотекстовой статьи на PRSGlobalOpen.com или по адресу http://links.lww.com/PRSGO/A203.

Footnotes

Представлено на IV Национальном Конгрессе, Москва, Россия, 3–5 декабря 2015 г. Эта статья. Плата за обработку статьи была оплачена авторами.

Для этой статьи доступен дополнительный цифровой контент.В тексте появляются ссылки на URL-адреса, доступные для кликов.

Пластическая хирургия, эстетическая медицина и косметология, IV Национальный Конгресс , Москва, Россия, 3-5 декабря 2015 г.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Рамирес О.М. Почему я предпочитаю эндоскопическую подтяжку лба. Plast Reconstr Surg. 1997; 100: 1033–1039. обсуждение 1043. [PubMed] [Google Scholar] 2. Simler AG. Эндоскопическая увеличивающая маммопластика: пупочный доступ. Plast Surg Nurs. 1994; 14: 149–153. [PubMed] [Google Scholar] 3. Hwang PH, McLaughlin RB, Lanza DC, et al.Эндоскопическая септопластика: показания, техника и результаты. Otolaryngol Head Neck Surg. 1999; 120: 678–682. [PubMed] [Google Scholar] 4. Eaves FF, III, Nahai F, Bostwick J., III Эндоскопическая абдоминопластика и миниабдоминопластика с эндоскопической поддержкой. Clin Plast Surg. 1996. 23: 599–616. обсуждение 617. [PubMed] [Google Scholar] 5. Пьетрабисса А., Сбрана Ф., Морелли Л. и др. Преодоление проблем холецистэктомии с одним разрезом с помощью роботизированной технологии с одним узлом. Arch Surg. 2012; 147: 709–714. [PubMed] [Google Scholar]

Овальбуминовая антиген-специфическая активация Т-клеточного рецептора очень похожа на стимуляцию растворимыми антителами, как показывает протеомика BOOST phosphotyrosine

Abstract

Активация Т-клеточных рецепторов (TCR) приводит к преимущественно организованной сети ранней передачи сигналов фосфорилированием тирозина в Т-клетках.TCR обычно активируют с использованием растворимых антител против TCR, но этот подход не является антиген-специфичным. Альтернативно, активация TCR с использованием специфических антигенов с диапазоном аффинностей связывания в форме комплекса пептид-главный гистосовместимость (pMHC) считается более физиологичной. Однако из-за отсутствия широкомасштабных протеомных исследований фосфотирозина (pTyr), напрямую сравнивающих антитела против TCR и pMHC, полное определение этих активированных состояний остается загадочным. Выяснение тирозинфосфопротеома с использованием количественной протеомики pTyr позволяет лучше понять уникальные особенности этих активирующих агентов и роль аффинности связывания лиганда в передаче сигналов.Здесь мы применяем недавно разработанную оптимизацию селективного запуска широкого спектра (BOOST) для изучения нарушений в фосфорилировании тирозина TCR, запускаемых антителами против TCR и pMHC. Наши данные показывают, что активация TCR высокоаффинным овальбумином (OVA) pMHC запускает в значительной степени сходную, хотя и потенциально более сильную, pTyr-опосредованную сигнальную регуляторную ось по сравнению с антителом против TCR. Выходной сигнал, возникающий в результате вариантов OVA pMHC, хорошо коррелирует с их более слабым сродством, что позволяет регулировать силу сигнала с помощью настраиваемого сродства.В совокупности мы обеспечиваем основу для применения BOOST для сравнения опосредованных pTyr сигнальных путей Т-клеток, активированных антиген-независимым и антиген-специфическим образом.

Введение

Взаимодействие между TCR и его антигенным лигандом является неотъемлемой частью того, как Т-клетки регулируют свои физиологические функции. Антиген-презентирующие клетки представляют эти антигены в форме pMHC на своей клеточной поверхности. Обнаружение и связывание TCR с его родственным pMHC с помощью стимуляции корецепторов позволяет внеклеточному взаимодействию передаваться через плазматическую мембрану в виде внутриклеточных сигнальных событий, что приводит к аккумулятору Т-клеточных ответов.Ранняя передача сигналов TCR преимущественно управляется фосфорилированием тирозина, посттрансляционной модификацией (PTM). При взаимодействии TCR с pMHC киназа Lck семейства Src фосфорилирует иммунорецепторные тирозиновые мотивы активации (ITAM) в CD3 и ζ цепях комплекса TCR ¹. Каждый ITAM состоит из пары сайтов фосфорилирования тирозина, разделенных высококонсервативным мотивом последовательности с определенным интервалом ². Фосфорилирование ITAM обеспечивает сайты стыковки, необходимые для зарождения образования сигнальных комплексов.Это делает возможным распространение сигнальных событий, необходимых для клеточных процессов, таких как дифференцировка и пролиферация Т-клеток. Однако ранние сигнальные события, опосредованные множеством фосфорилирования тирозина, не полностью изучены из-за проблем с изучением фосфорилирования тирозина с низким содержанием в протеоме (<1% от общего фосфорилирования ³) и ограничений методов, использующих специфичные для фосфорилирования антитела. ^{4, 5}.

Основанная на масс-спектрометрии (МС) протеомика pTyr стала привлекательным методом для исследования нарушений фосфорилирования тирозина в протеоме с высокой пропускной способностью и беспристрастным образом.Чтобы преодолеть проблемы, связанные с идентификацией и количественной оценкой фосфорилирования тирозина с низким содержанием в масс-спектрометрии, мы недавно разработали подход BOOST для увеличения глубины количественного определения фосфопротеома тирозина при сохранении количественной точности ⁶. Вкратце, буст-каналы перванадата (PV) были введены в эксперименте TMT, чтобы запустить селективную фрагментацию пептидов pTyr, облегчая количественное определение репортерных ионов в не-бустерных каналах в режиме сбора данных, зависимого от данных (DDA).Это возможно, потому что PV является мощным ингибитором тирозинфосфатазы широкого спектра действия, который увеличивает количество сайтов pTyr в протеоме ⁷, тем самым увеличивая интенсивность мультиплексированных ионов-предшественников, содержащих pTyr. Тем не менее, не было продемонстрировано, что BOOST может применяться помимо исследования, подтверждающего концепцию, для получения полезных биологических представлений об иммунной системе. Здесь мы пытаемся выявить различия в путях передачи сигналов, опосредованных pTyr, или их отсутствие в антиген-независимой и антиген-специфической активации TCR.

Из-за простоты использования многие протеомные исследования, изучающие сигнальные пути Т-клеток, обычно полагались на антиген-независимую активацию Т-клеток на основе антител ^{8, 9}. Моноклональные антитела, такие как C305 ¹⁰ и OKT3 ¹¹, являются популярными реагентами, используемыми для активации Т-клеток путем связывания с TCR для имитации кластеризации TCR, когда TCR взаимодействует с pMHC. Однако запуск TCR с использованием антител не является антиген-специфичным ¹², может страдать от аберрантных иммунных ответов ¹³, ¹⁴ и может приводить к несоответствиям в передаче сигналов из-за отсутствия стимуляции корецепторов ¹⁵.Чтобы преодолеть эти осложнения, OT-1 TCR был охарактеризован и разработан как более физиологическая модельная система для изучения антиген-специфической передачи сигналов TCR ^16-18. OT-1 TCR распознает пептид, производный от овальбумина курицы OVA257-264 (SIINFEKL), связанный с тетрамером MHC, как агонист с сильным сродством связывания ^{19, 20}, чему способствует взаимодействие корецептора CD8 с MHC ²¹. Панель измененных пептидных лигандов OVA с последовательно сниженной аффинностью связывания также была впоследствии охарактеризована ^{20, 22}.В наших попытках лучше понять передачу сигналов Т-клеток, антигенный тетрамер pMHC может быть более подходящим активирующим агентом по сравнению с антителом против TCR. Физиологически сродство к антигену может приводить к различным биологическим результатам для Т-клеток, потому что рМНС с высоким сродством индуцирует отрицательный отбор, в то время как рМНС с низким сродством ведет к положительному отбору во время развития тимуса ²³. Механически различия в аффинности лигандов также формируют основу модели кинетической корректуры в инициации TCR, проявляясь в отличной кинетике связывания ²⁴, ²⁵.Из-за отсутствия широкомасштабных протеомных исследований pTyr, непосредственно сравнивающих pMHC и антитела против TCR, остается загадкой, привели ли ограничения в подходе, основанном на антителах, к несоответствиям в путях передачи сигналов, опосредованных pTyr, которые могли бы опровергнуть предыдущие результаты в биологии Т-клеток. .

Кроме того, моноклональные антитела против TCR ²⁶ и тетрамеры pMHC ²⁷ стали бесценными иммуномодулирующими агентами в сочетании с лекарствами, направленными на тирозинкиназу ²⁸ для иммунотерапии.Однако методы систематической оценки нарушений, вызванных фосфорилированием, с помощью этих клинически значимых иммуномодуляторов, полностью не разработаны.

Здесь мы предоставляем основу, основанную на подходе BOOST, для систематической объективной оценки вызванных фосфорилированием тирозина возмущений антителами против TCR и тетрамерами pMHC. Мы используем недавно созданную линию Т-клеток Jurkat, экспрессирующую OT1 TCR и корецептор CD8, в качестве антиген-специфической модельной системы TCR, чтобы обеспечить считывание передачи сигналов TCR на основе различной аффинности измененных пептидных лигандов OVA pMHC.Мы также напрямую сравниваем его с опосредованными pTyr сигнальными путями, запускаемыми активацией TCR, опосредованной антителами. Мы впервые демонстрируем полезность BOOST в качестве метода протеомики pTyr для выявления биологических представлений, опосредованных фосфорилированием тирозина в Т-клетках. В совокупности этот подход позволяет воспроизводить количественную оценку около тысячи сайтов pTyr вместе в этом наборе данных. Мы оцениваем нарушения в сигнальных путях, связанные с этими сайтами pTyr, и анализируем сходства и различия между антиген-специфической активацией рецептора ОТ-1 и стимуляцией, направленной антителами.Важно отметить, что мы подчеркиваем, как мы оптимизируем экспериментальный план BOOST, и тщательно оцениваем качество данных. Наконец, мы демонстрируем потенциальные применения BOOST для расширения нашего понимания механизмов заболевания и обсуждаем преимущества регулируемого по аффинности антиген-специфического pMHC, позволяющего более точно контролировать силу передачи сигналов TCR.

Экспериментальные методы

Клеточная линия и культура клеток

Клетки Jurkat OT1 + CD8 + (J.OT1) были созданы с использованием лентивирусных и ретровирусных векторов, как подробно описано ранее ²¹.Вкратце, лейкозная линия Т-клеток Jurkat человека (клон E6-1), которая была сделана Lck-дефицитной с использованием CRISPR-Cas9, была впоследствии трансдуцирована OT-I TCRβ и OT-I TCRα, hCD8β-T2A-hCD8α и Lck с помощью C- конечная последовательность FLAG.

Клетки J.OT 1 поддерживали в RPM1 1640, содержащем 2,05 мМ L-глутамина с добавлением 100 Ед / мл пенициллина G, 100 мкг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина (HyClone) и 10% (об. / Об.) Тепла. -инактивированная фетальная бычья сыворотка (Peak Serum) в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ при 37 ° C.Клетки, использованные в этой работе, подтвердили, что они свободны от микоплазм, с помощью набора для обнаружения микоплазм ПЦР (Applied Biological Materials G238) в соответствии с инструкциями производителя.

Стимуляция Т-клеточного рецептора

Метод стимуляции клеток J.OT1 основан на ранее проведенном исследовании ²¹. Для каждого повтора для каждого условия 15 миллионов клеток J.OT1 промывали и ресуспендировали в бессывороточной RPMI при концентрации 50 миллионов клеток на мл. Затем клетки инкубировали либо с 10 нМ тетрамера H-2K ^b MHC (класс I, бета-2-микроглобулин человека), либо с ~ 1 мкг / мл анти-CD3 IgM-антитела C305 на льду в течение 1 часа.C305 разводили в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS) перед стимуляцией. Тетрамеры MHC ²⁹ были синтезированы NIH Tetramer Core Facility (Атланта, Джорджия) с использованием пользовательских пептидов из GenScript. Пептидные последовательности: SIINFEKL (OVA), SIITFEKL (T4), SIIGFEKL (G4) и RGYVYQGL (VSV). Стимуляцию инициировали переносом клеток изо льда до 37 ° C. После 3 минут стимуляции при 37 ° C клетки лизировали равным объемом буфера для лизиса (pH 7,6), содержащего 1% (мас. / Об.) Додецилсульфата натрия (SDS), 100 мМ трис-HCl и 1X протеазу MS-SAFE и Коктейль с ингибиторами фосфатазы (Sigma-Aldrich MSSAFE).Обработку PV проводили путем инкубации клеток J.OT1 с 500 мкМ PV (полученного смешиванием равного объема 1 мМ ортованадата натрия и 1 мМ пероксида водорода) в течение 10 минут при 37 ° C и лизирования с буфером для лизиса, как указано.

Обработка образцов для протеомного анализа

Лизат наносили через мини-вращающуюся колонку QIAshredder для снижения вязкости лизата центрифугированием при 20000 x g при 37 ° C в течение 5 минут. Концентрацию белка в осветленном лизате определяли с помощью анализа протеина Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, 23225), после чего ее снижали с помощью 100 мМ дитиотреитола при комнатной температуре в течение 30-60 минут.Затем лизат обрабатывали с использованием метода подготовки проб с фильтрацией (FASP) ³⁰, как описано. Вкратце, 8 М мочевину в 100 мМ трис-HCl, pH 8,5 (UA) использовали для разбавления концентрации SDS лизата не более чем до 0,2% (мас. / Об.). Лизат, содержащий 200 мкг белка, наносили центрифугированием на каждую фильтровальную единицу Microcon-30 Ultracel PL-30 Regenerated Cellulose 30000 NMWL (Millipore, MRCF0R030) (1 мг белка на реплику, используя всего 5 фильтровальных единиц). 50 мМ йодацетамида в UA добавляли в блок фильтра и инкубировали в темноте в течение 30 минут для алкилирования белка.Затем фильтрующие элементы промывали UA и 50 мМ бикарбонатом аммония перед добавлением трипсина (Promega, V5113) при 37 ° C в течение ночи при соотношении трипсин: белок (мас. / Мас.) 1:40. Расщепленные пептиды собирали и подкисляли трифторуксусной кислотой (TFA) и обессоливали с использованием картриджа Sep-Pak C18 (Waters WAT020515), как описано ³¹.

Маркировка TMT

Метод BOOST был недавно представлен ⁶ и принят в этом исследовании с небольшими изменениями. Обессоленные пептиды метили с использованием набора реагентов для изобарической метки Tandem Mass Tag 11-plex (ThermoFisher # A34808) со следующей установкой.Клетки, обработанные PV, использовали в качестве образцов в канале Boost (TMT126) во всех смесях TMT. Чтобы предотвратить вмешательство репортерных ионов изотопов ¹⁵ N и ¹³ C TMT126, которые могут отрицательно повлиять на количественный анализ, ³², TMT127N и TMT127C были оставлены пустыми и неиспользованными. Остальная часть примерной настройки канала подробно описана на Рисунке 1C. Чтобы инициировать метку TMT, 1250 мкг метки TMT (ресуспендированной в 63 мкл ацетонитрила) добавляли к пептидам (ресуспендированным в 150 мкл 100 мМ бикарбоната триэтиламмония), полученным из 1 мг белка, в течение 3 часов при комнатной температуре.Реакцию мечения останавливали добавлением 12 мкл 5% (об. / Об.) Гидроксиламина в течение 15 минут при комнатной температуре. Чтобы учесть вариацию в содержании пептидов, часть индивидуально меченых пептидов из каждого канала TMT в одной и той же смеси объединяли в равных количествах для общего анализа пептидов. Вкратце, небольшую аликвоту (~ 2%) индивидуальных TMT-меченых пептидов объединяли и вводили в ЖХ-МС без фракционирования и проводили поиск с использованием фиксированной модификации TMT11, сохраняя при этом все остальные параметры идентичными, как описано ниже.Отдельный поиск с использованием переменной модификации TMT дал среднюю эффективность маркировки TMT ~ 99% для всех четырех смесей TMT. Используя данные поиска фиксированных модификаций, медианные интенсивности каждого из этих каналов TMT были использованы для нормализации для объединения оставшихся ~ 98% TMT-меченых пептидов в равных количествах. Концентрация ацетонитрила в объединенной смеси пептидов была снижена до менее 2% (об. / Об.) И подкислена до 1% TFA (об. / Об.) Перед обессоливанием с использованием картриджа Sep-Pak C18 (Waters WAT020515) и лиофилизацией на лиофилизатор перед продолжением обогащения пептидом pTyr, как описано ⁶.

Рисунок 1:

(A) Иллюстрация различий между антиген-независимым и антиген-специфическим запуском TCR. Здесь антитело против TCR используется для антиген-независимой активации, в то время как тетрамер OVA pMHC, нацеленный на OT-1 TCR, используется для антиген-специфической активации передачи сигналов Т-клетками. Для ясности МНС изображен как мономер, а не тетрамер. (B) Аминокислотная последовательность различных измененных пептидных лигандов пептида OVA. Изменение пептидной последовательности снижает аффинность связывания pMHC с OT-1 TCR.(C) Примерное обозначение каналов TMT, используемых в этом исследовании. Всего было использовано четыре смеси TMT11. Образцы, обработанные PV, были помечены TMT126 как канал BOOST для увеличения глубины количественного определения фосфопротеома тирозина. Для сравнения Ab, DPBS использовали в качестве нестимулированного контроля, поскольку антитело против TCR разводили в DPBS, тогда как для сравнения OVA, T4 и G4 pMHC использовали нулевой пептид VSV pMHC в качестве их соответствующего нестимулированного контроля. (D) Обзор экспериментального потока.Т-клетки Jurkat, экспрессирующие OT-1 TCR, стимулировали, как показано на (C), и лизировали буфером для лизиса SDS. Лизат восстанавливали, алкилировали и расщепляли с использованием методов подготовки проб с фильтрацией (FASP). Расщепленные пептиды обессоливали на колонке C18 с обращенной фазой и затем метили TMT перед обогащением пептидом pTyr с использованием суперсвязывания sSh3. Протеомные данные собирали на масс-спектрометре с использованием параметров MS3 синхронного выбора предшественников (SPS). Более подробную информацию можно найти в разделе «Экспериментальные методы».

Обогащение пептида pTyr с использованием Sh3 superbinder

Superbinder домена Src Sh3 очищали и иммобилизовали на CNBr-активированной сефарозе (GE Healthcare) в буфере IAP (50 мМ MOPS-NaOH [pH7,2], 10 мМ фосфата натрия, 50 мМ Хлорид натрия), как описано ⁴, в концентрации 2,4 мг белка на мл суспензии гранул (50 мг гранул сефарозы на мл). 9 мг обессоленных пептидов, меченных TMT, ресуспендировали в 2,8 мл буфера IAP и затем добавляли к 2 мг иммобилизованного суперсвязывания Sh3 для инкубации на ротаторе в течение ночи при 4 ° C.Гранулы промывали 3 раза ледяным буфером IAP и один раз ледяной водой, пригодной для ВЭЖХ. Все промывки и удаление супернатанта гранул во время процедуры обогащения выполняли с использованием скорости центрифугирования 1500 x g при 4 ° C в течение 2 минут, если не указано иное. Пептиды элюировали из шариков дважды, каждый с использованием 200 мкл 0,15% (об. / Об.) TFA в течение 10 минут при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Элюированные пептиды обессоливали с использованием наконечников C18 на 100 мкл (Thermo Scientific Pierce), следуя инструкциям производителя, и сушили в быстром вакууме.

Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия

Для автономного основного (pH 10) фракционирования пептиды разделяли на колонке Acquity BEH C18 (Waters) размером 100 мм x 1,0 мм с использованием системы UHPLC UltiMate 3000 (ThermoFisher Scientific) с 40-минутным интервалом. градиент от 1% до 40% Буфер B _{основной} на 36 фракций, которые впоследствии объединяются в 12 суперфракций (Буфер A _{основной} = 10 мМ гидроксид аммония в 99,5% (об. / об.) воде для ВЭЖХ, 0,5 % (об. / об.) ацетонитрил для ВЭЖХ; буфер B _{основной} = 10 мМ гидроксид аммония в 100% ацетонитриле для ВЭЖХ).Каждую суперфракцию далее разделяли на встроенной аналитической колонке с обращенной фазой 150 мм x 75 мкм, заполненной смолой XSelect CSH C18 2,5 мкм (Waters), используя систему UltiMate 3000 RSLCnano (ThermoFisher Scientific), при скорости потока 300 нл / мин. Пептиды элюировали с использованием 65-минутного градиента от 5% до 30% буфера B _{, кислотного}, с последующим 6-минутным градиентом от 30% до 90% кислотного буфера (буферный раствор = 0,1% (об. / Об.) Муравьиной кислоты в 99,4%). % (об. / об.) воды для ВЭЖХ, 0,5% (об. / об.) ацетонитрила для ВЭЖХ; буфер B _{основной} = 0.1% (об. / Об.) Муравьиной кислоты в 99,9% (об. / Об.) Ацетонитриле для ВЭЖХ). Данные были получены в режиме DDA на масс-спектрометре Orbitrap Eclipse Tribrid (ThermoFisher Scientific) с положительным напряжением распыления 2,25 кВ с использованием многоточечных настроек TMT-MS3 ³³. Время цикла было установлено на 2,5 секунды. При сканировании на уровне MS1 ионы-предшественники (зарядовые состояния 2-5) регистрируются детектором Orbitrap с диапазоном сканирования 400-1600 м / з, разрешением 120000, максимальным временем впрыска 50 мс, целью автоматической регулировки усиления (AGC) 800000 и время динамического исключения 15 секунд.Ионы-предшественники MS1 выделяли на квадруполе с использованием изоляционного окна 0,7 m / z для сканирования MS2. Сканы MS2 получали в режиме центроида на детекторе с ионной ловушкой в диапазоне сканирования 400-1400 m / z посредством активации диссоциации с более высокой энергией (HCD, энергия 33%) с мишенью AGC 5000, максимальное время инжекции 75 мс. Используя синхронный выбор предшественника (SPS) ³³, 10 выемок были дополнительно изолированы на квадруполе с использованием окна изоляции MS2 3 m / z для сканирований MS3, которые регистрируются детектором Orbitrap в диапазоне сканирования 100-500 м / z. z с разрешением по массе 50 000 через активацию HCD (энергия 55%) с целью AGC 250 000 и максимальным временем впрыска 150 мс в режиме центроида.

Параметры поиска в базе данных и критерии приемлемости для идентификации

Необработанные файлы были обработаны в MaxQuant ³⁴ версии 1.6.17.0 с использованием интегрированного механизма поиска пептидов Andromeda ³⁵. Спектры МС / МС анализировали в базе данных UniProt человека ( Homo sapiens , последнее изменение 12.01.2019), содержащей 74 811 прямых последовательностей белка. Частота ложного обнаружения (FDR) совпадений пептидного спектра (PSM) была установлена на уровне 1% с использованием подхода с обратной базой данных-ловушек.Карбамидометилирование (цистеин) было задано как фиксированная модификация, тогда как окисление (метионин), ацетилирование (N-концы белка) и фосфорилирование (серин, треонин, тирозин) были заданы как переменные модификации. Специфичность фермента трипсина была использована с двумя пропущенными расщеплениями. Толерантность к основному поисковому пептиду была установлена на уровне 3 частей на миллион, в то время как допуски совпадения МС / МС FTMS и ITMS были установлены на уровне 20 частей на миллион и 0,5 Да, соответственно. Допуск по массе репортерного иона MS3 был установлен на уровне 3 мДа с использованием изотопных поправочных коэффициентов, предоставленных производителем (лот UK291565, лот Uh383151).Соответствие между прогонами было включено с параметрами по умолчанию. Как было опубликовано ранее ⁶, вменение или интерполяция пропущенных значений не использовались при анализе данных TMT. Файл параметров поиска (mqpar.xml) выполнения MaxQuant предоставляется как файл S1.

Иммуноблоттинг

Для приготовления клеточного лизата для иммуноблоттинга осадки клеток ресуспендировали в буфере для загрузки образца (2% мас. / Об. SDS, 62,5 мМ трис-HCl, 10% об. / Об. Глицерина, 2,5% об. / Об. 2-меркаптоэтанола, 0,05% бромфенолового синего) и кипятили при 95 ° C в течение 10 минут.Приблизительно 500000 эквивалентов клеток или 25 мкг белка загружали в каждую лунку гелей ClearPAGE с 4-20% градиентом полиакриламида (Expedeon) и разделяли денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле при 100 В в течение 1 часа. Белки, разделенные гель-электрофорезом, переносили на PVDF-мембрану Immobilon-FL (EMD Millipore) при 100 В в течение 90 минут в ледяном буфере для переноса (25 мМ Трис, 200 мМ глицин, 20% об. Метанола). Затем мембраны блокировали блокирующим буфером Odyssey (Li-Cor) при комнатной температуре в течение 1 часа перед инкубацией с первичными антителами при 4 ° C в течение ночи и последующей инкубацией с вторичными антителами, конъюгированными с IRDye (Li-Cor), в течение 1 часа при комнатной температуре.Мембраны промывали DPBS, содержащим 0,1% об. / Об. Твин, после каждой инкубации антител. Анти-GAPDH был от Sigma-Aldrich (G9545, разведение 1: 10000). Антитело против фосфотирозина (4G10, 05-321) было от Millipore. Анти-p44 / 42 MAPK (Erk1 / 2, 9107), анти-фосфо-p44 / 42 MAPK (Erk1 / 2, Thr202 / Tyr204, 9101), анти-Zap70 (3165), анти-Zap70 pTyr493 (2704) и анти-Zap70. -LAT pTyr191 (pTyr220 в изоформе 1, 3548) антитела были от Cell Signaling Technologies. Вторичные антитела против IgG кролика (926-68071), конъюгированные с IRDye 680RD, и вторичные антитела против IgG мыши (926-32212), конъюгированные с IRDye 800CW, были от Li-Cor.Все первичные антитела разводили 1: 1000 (об. / Об.), Тогда как все вторичные антитела разводили 1: 10000 (об. / Об.), Если не указано иное. Блоты визуализировали с помощью системы визуализации Odyssey CLx и количественно оценивали с помощью программного обеспечения ImageStudio (Li-Cor).

Анализ данных

Для анализа уровня PSM использовался файл «inventory.txt» (таблица S1), созданный из MaxQuant. Уникальный PSM определяется соответствием пептидного спектра с неизбыточной аминокислотной последовательностью, модификациями и состоянием заряда с наименьшим количеством пропущенных значений по всем каналам TMT.Если избыточность все еще существует, сохраняется PSM с наивысшей средней интенсивностью репортерных ионов. Для анализа уровня pTyr использовали «Phospho (STY) Sites.txt» (Таблица S2) от MaxQuant. После удаления обратных попаданий и потенциальных загрязнителей в анализ были включены только сайты pTyr класса I (вероятность локализации> 0,75). Репортерные ионы из TMT126 (образцы, обработанные PV) и TMT127N-TMT127C (холостые) были исключены из всех количественных анализов, если не указано иное. Непарный t-критерий Стьюдента был выполнен с использованием скорректированных значений интенсивности фосфозита между 4 повторами каждого парного состояния в одной и той же смеси TMT для определения значений p, из которых скорректированы до значений q для учета FDR в гипотезе множественного тестирования ³⁶ .Графики вулканов были построены с использованием -log ₁₀ (значения q) и log ₂ (кратное изменение средней интенсивности участков pTyr) стимулированного состояния по сравнению с соответствующим контролем, как подробно показано на рисунке 1C, с требованием, чтобы по крайней мере 3 из из 4 повторов для каждого из парных условий для одного и того же сайта pTyr содержали интенсивность репортерного иона больше нуля. Как было опубликовано ранее ⁶, вменение или интерполяция пропущенных значений не использовались ни в какой части анализа данных.Сайты pTyr со значениями q менее 0,05 считались статистически значимыми. Сайты pTyr также были аннотированы в базе данных KEGG на основе регистрационного номера Uniprot соответствующего белка с использованием Perseus ³⁷. Тепловая карта интенсивности изменения складки сайта pTyr была создана после выполнения иерархической кластеризации на основе евклидовых расстояний между средними кластерами с использованием метода полной связи. Из-за длины тепловой карты отношения всего набора данных предоставляется интерактивная тепловая карта, которую можно просматривать в интерактивном режиме в Интернете (подробности в файле S2).Для анализа обогащения сигнатур PTM (PTM-SEA) мы использовали методологию, разработанную Krug et al. ³⁸ и сценарии R от Storey et al. ³⁹ с использованием 7 аминокислот, фланкирующих каждый сайт pTyr, со следующими модификациями. Входные данные для PTM-SEA были изменены, чтобы представлять собой вектор логарифмически преобразованных значений q, умноженных на знак среднего log2 отношения репортерных ионов, вместо значений p. Результирующая формула: -log10 (значение q) * знак [log2 (кратное изменение сайта pTyr)] . Чтобы полностью уловить дисперсию, наблюдаемую между повторами, мы применили подход, аналогичный Krug et al.для включения величины значений q фосфозита в определение показателей обогащения для каждой из категорий сигнатур без нормализации ранга и путем установки весового параметра на 1 ³⁸. Диаграмма Венна была создана с помощью InteractiVenn. Все анализы и построение графиков выполнялись в Microsoft Excel или с использованием статистического языка R (4.0.3) в RStudio (1.1.447) с использованием пакетов «tidyverse» (1.3.0), «qvalue» (2.22.0), «ggdendro». (0.1.22), «сюжетно» (4.9.3), «RColorBrewer» (1.1-2), «pacman» (0.5.1), «rhdf5» (2.34.0) и «cmapR» (1.2.1), загруженные с CRAN или Bioconductor. Все сценарии R, использованные в этом исследовании, доступны для загрузки в (Файлы S3-6). Количественный анализ иммуноблотов представлен в файле S7. Аннотированные KEGG сайты pTyr можно найти в таблице S3.

Результаты

Экспериментальный дизайн и обоснование BOOST

Мы приступили к изучению путей передачи сигналов pTyr, запускаемых антиген-независимой или антиген-специфической активацией TCR, с использованием недавно разработанного нами подхода BOOST.Вкратце, PV-обработанные образцы в TMT-мультиплексированной стратегии BOOST обеспечивают более глубокую количественную глубину pTyr за счет избирательного запуска фрагментации pTyr-содержащих ионов-предшественников, тем самым облегчая количественный анализ репортерных ионов в представляющих интерес образцах. Мы проверили эффективность PV путем изучения повышения уровня общего фосфорилирования тирозина в протеоме образцов, обработанных PV, в иммуноблоттинге (рисунок S1). Мы использовали Jurkat T-клетки, экспрессирующие OT-1 TCR и корецептор CD8, в качестве модельной системы для антиген-специфической активации TCR (рис. 1A), поскольку было продемонстрировано, что TCR OT-1 связывает тетрамеры H-2K ^b OVA pMHC класса I. с высоким сродством ¹⁹, ²⁰.Кроме того, была охарактеризована панель вариантов пептида OVA с последовательно сниженной аффинностью связывания, из которых мы исследовали антигены T4 (средняя аффинность), G4 (низкая аффинность) и VSV (нулевой пептидный контроль) в этом исследовании (рисунок 1B). Чтобы свести к минимуму расхождения в передаче сигналов из-за гетерогенности, возникающей из разных клеточных линий, мы использовали одну и ту же клеточную линию Jurkat OT-1 для всех условий в этом исследовании, потому что эта клеточная линия также может быть стимулирована антителом C305 IgM, нацеленным на TCR Vbeta ¹⁰, ²¹ антиген-независимым образом (рис. 1А).Это позволяет более прямое сравнение считывания сигналов TCR только от активирующего агента.

Чтобы количественно охарактеризовать различия в сигнальных путях, индуцированных этими активирующими агентами, мы провели многопользовательский эксперимент TMT BOOST для исследования изменений в сайтах pTyr в результате активации TCR анти-TCR антителом (Ab), OVA pMHC ( OVA), T4 pMHC (T4) и G4 pMHC (G4) в четырех экземплярах каждый (рис. 1C). Соответствующие элементы управления были выбраны для каждого из этих условий.Поскольку в этом эксперименте Ab разводили в DPBS, DPBS использовали в качестве контроля без антител, а неродственный вирус везикулярного стоматита pMHC (VSV) использовали в качестве контроля с нулевым пептидом для pMHC OVA, T4 и G4. TMT126 был обозначен как канал повышения PV, за которым следуют 2 пустых канала в TMT127N и TMT127C, чтобы избежать вмешательства репортерных ионов изотопных примесей из реагента для метки TMT ³² (рис. 1C). Образцы были помечены TMT и обогащены pTyr-содержащими пептидами с использованием суперсвязывания sSh3 перед количественным анализом репортера TMT на основе MS3 (рис. 1D).Селективность обогащения pTyr была продемонстрирована, поскольку большинство идентифицированных сайтов фосфорилирования было локализовано на остатках тирозина, при этом 94% сайтов pTyr были отнесены MaxQuant к классу сайтов I (рис. S2).

Оценка качества и точности данных

Чтобы гарантировать, что канал повышения PV не оказывает отрицательного воздействия на биологическую интерпретацию данных, мы сначала проверили несколько показателей, чтобы оценить общее качество данных. Как и ожидалось в эксперименте BOOST, включение канала повышения PV привело к большему количеству поддающихся количественной оценке уникальных PSM с ~ 7-10X интенсивностями репортерных ионов в TMT126 по сравнению с другими каналами TMT; этот эффект характерен только для PSM с модификациями pTyr во всех условиях (рисунок S3A-D).Стратегическое размещение 2 пустых каналов позволило нам избежать интерференции репортерных ионов из-за изотопных примесей из канала повышения PV (рис. S3A-D). Важно отметить, что включение канала повышения PV по-прежнему привело к хорошей количественной точности со средними коэффициентами вариации (CV) менее 20% во всех условиях для pTyr-содержащих PSM биологических реплик, выполненных в этом исследовании (Рисунок S4). Мы приписываем наблюдаемую количественную точность средним уровням усиления репортерных ионов PV в умеренных 4-30 раз по сравнению со средней экспериментальной интенсивностью репортерных ионов pTyr-содержащего PSM, в зависимости от количества пропущенных значений (Рисунок S5).Важно отметить, что уровни повышения для PSM без модификации (-ий) pTyr остаются неизменными на протяжении всего периода, что позволяет предположить, что эффект канала повышения PV является высокоспецифичным и целевым (Рисунок S5). Более подробная интерпретация этих данных представлена в разделе «Обсуждение». В целом, общее качество данных и хорошая количественная точность обеспечили уверенность в интерпретации нашего последующего анализа данных.

OVA инициировал аналогичную, но потенциально более сильную передачу сигналов по сравнению с Ab

Чтобы изучить изменения количества сайтов pTyr в зависимости от статистической значимости, мы визуализировали кратные изменения каждого количественно определенного сайта pTyr на графиках вулканов (рис. 2A-E).Для поддержания статистической строгости нам потребовалось минимум 3 из 4 повторов с поддающимися количественной оценке репортерными ионами для каждого условия в рамках сравнения, чтобы можно было рассчитать значение q (значение p с поправкой на FDR), в результате чего в общей сложности было получено 996 сайтов pTyr. которые можно изучить с помощью анализа графика вулканов (рис. 2F). Сайты pTyr со значением q менее 0,05 считаются статистически значимыми или дифференциальными. Среди этих дифференциальных сайтов pTyr многие из этих сайтов обнаружены в белках, которые, как известно, активируются и фосфорилируются при активации Т-клеток, особенно в цепях CD3 и CD247 (ζ), составляющих часть комплекса TCR.Мы не только идентифицировали все сайты pTyr ITAM в цепях CD3 и CD247 (ζ) (CD247 Y72 / Y83, Y111 / Y123, Y142 / Y153; CD3D Y149 / Y160; CD3E Y188 / Y199; CD3G Y160 / 171), но и наши данные показали, что почти все эти ITAM сайты pTyr были статистически увеличены как в Ab, так и в OVA после активации TCR (Рисунок 2A-C, Рисунок 3A). Эти сходства в различных сайтах ITAM предполагают, что сравнимый ранний механизм передачи сигналов между Ab и OVA, хотя величина фосфорилирования ITAM была в основном больше для сильного агониста OVA (Рисунок 3A).Например, OVA вызвал до 6-кратное увеличение сайтов ITAM, но только примерно до 3-кратного увеличения наблюдалось для Ab (рис. 3A). Более того, большинство кратных изменений в сайтах pTyr, участвующих в передаче сигналов TCR, которые были индуцированы OVA, также были выше, чем у Ab (рис. 3B), что свидетельствует о более сильном сигнальном выходе в целом. Возможно, что в образцах, активированных OVA, наблюдался более сильный эффект из-за вклада корецептора CD8, который специфически связывается с MHC. Эти данные согласуются с перекрытием дифференциальных сайтов между Ab и OVA, где 27 из 40 (или примерно 7 из 10) сайтов pTyr, которые были идентифицированы как статистически значимые для Ab, также были аналогичным образом идентифицированы в OVA, но у OVA было ~ 1.В 7 раз больше дифференциальных сайтов pTyr, чем у Ab (рис. 2F). Интересно, что OVA-специфические дифференциальные сайты pTyr также включают несколько хорошо известных негативных регуляторов TCR, таких как UBASh4A, PAG1 и PTPN6 (SHP-1) (рис. 2A, C), что, возможно, указывает на инициирование регуляции отрицательной обратной связи, подавляющей сильную передачу сигналов, индуцированную. пользователя OVA. Взятые вместе, наши данные предполагают близкое сходство в ранней передаче сигналов pTyr между антиген-независимыми Ab и антиген-специфической OVA pMHC активацией TCR, но одновременно указывают на более сильный выходной сигнал, индуцированный высокоаффинным антигеном OVA.

Рисунок 2:

(A) Volcano графики количественной оценки кратных изменений сайтов pTyr во всех четырех сравнениях TMT, как показано на рисунке 1C, для сайтов pTyr по крайней мере с 3 из 4 каналов с количественно определенными ионами-репортерами в каждом условии сравнения. Вертикальные пунктирные линии представляют 2-кратное увеличение или уменьшение количества сайта pTyr. Горизонтальная пунктирная линия показывает граничное значение q, равное 0,05. Сайты pTyr со значениями q ниже 0,05 считаются статистически значимыми. Значимые сайты pTyr помечены с использованием обозначения [имя_гена] _ [Y] [номер-остатка] (для краткости вместо названия белка используется название гена).Сайты pTyr, происходящие от дважды фосфорилированных пептидов, помечены скобкой, содержащей второй сайт фосфорилирования с наивысшей вероятностью локализации. Сайты pTyr без скобок происходят от однократно фосфорилированных пептидов. Чтобы обеспечить лучшую видимость, значимые сайты pTyr в областях, отмеченных рамкой, масштабируются и помечаются отдельно в (B-E). (B-E) Значимые сайты pTyr (q <0,05) показаны и помечены для сравнения Ab (B), OVA (C), T4 (D) и G4 (E). Чтобы еще больше отбросить значимые сайты pTyr, сайты с более чем 2-кратным изменением выделены жирным шрифтом.(F) Диаграмма Венна, показывающая количество перекрывающихся сайтов pTyr, идентифицированных на графиках вулканов в (A), между каждым условием. Количество дифференциальных (q <0,05) сайтов pTyr ( n ) показано жирным шрифтом вверху, а количество всех сайтов pTyr ( N ) показано курсивом внизу. В N требовалось указать минимум 3 из 4 повторов с поддающимися количественной оценке репортерными ионами для каждого условия в рамках сравнения.

Рисунок 3:

(A) Средние кратные изменения интенсивности pTyr сайтов ITAM в цепях ζ и CD3 показаны для каждого стимулированного состояния по сравнению с его соответствующим нестимулированным контролем, как подробно показано на рисунке 1C.* над полосой указывает статистически значимый участок, определяемый значением q менее 0,05. (B) График плотности, показывающий распределение соотношения кратных изменений интенсивностей парных сайтов pTyr (сигнальные белки KEGG TCR) в OVA / VSV, T4 / VSV и G4 / VSV относительно Ab / DPBS. Пунктирная вертикальная линия указывает медианное значение всех соотношений кратных изменений, которое также численно указано на графике. Здесь коэффициент кратности изменения, равный 1, указывает, что кратное изменение в сайте pTyr, индуцированное pMHC, эквивалентно кратному изменению в том же сайте pTyr, индуцированному Ab, по сравнению с их соответствующим нестимулированным контролем, соответственно.

Сила передачи сигналов, индуцированная PMHC, соответствовала аффинности связывания

Чтобы проверить, может ли предсказанная аффинность связывания OVA, T4 и G4 pMHC (рис. 1B) быть отражена в показаниях силы передачи сигналов TCR, индуцированной фосфорилированием тирозина, мы затем сравнили дифференциальные сайты pTyr, вызванные этими антигенами. Действительно, общая величина силы передачи сигналов Т-клеток, обусловленная изменениями в фосфорилировании тирозина, отражалась кратными изменениями сайтов ITAM и относительными кратными изменениями сайтов pTyr, участвующих в передаче сигналов TCR (рис. 3A-B), что согласуется с предсказал сродство связывания pMHC.В то время как все сайты pTyr ITAM, кроме одного, были статистически значимыми для OVA, только 4 были различны для T4 и ни одного — для G4 (рис. 3A). Кроме того, всего 67 сайтов pTyr были статистически значимыми для OVA, в то время как только 19 и 8 дифференциальных сайтов pTyr были идентифицированы в T4 и G4 соответственно, несмотря на сравнительно одинаковое количество общих сайтов pTyr, проанализированных в каждом состоянии (рис. 2F). Например, активирующие сайты pTyr многих охарактеризованных ранних сигнальных белков TCR, таких как Lck Y394 ⁴⁰, Zap70 Y493 ⁴¹, LAT Y220 ⁴², ITK Y512 ⁴³ и PLCG1 Y771 ⁴⁴, были статистически увеличивается в антигенах с высоким сродством OVA, но не в антигенах со средней или низкой аффинностью T4 и G4 (рис. 2A, 2C-E).Однако эти антигены обычно запускали аналогичный, но более слабый выходной сигнал, поскольку мы все еще наблюдали небольшую, но заметную индукцию ZAP70, LAT, цепей CD3 и сайтов CD247 pTyr в T4 (рис. 2D). В совокупности несоответствие в дифференциальных сайтах pTyr между OVA, T4 и G4 показало, насколько эффективно BOOST может различать pMHC с разной аффинностью связывания на основе считывания силы передачи сигналов TCR, индуцированной фосфорилированием тирозина.

Проверка протеомных данных выявила сходство в последующих путях активации MAPK

Чтобы продемонстрировать, что количественное определение протеомных данных BOOST точно отражает клеточное состояние наших экспериментальных образцов, мы попытались проверить наши протеомные данные, используя альтернативный подход, такой как иммуноблоттинг. .Интересно, что только 2 сайта pTyr были статистически увеличены во всех 4 условиях, а именно MAPK1 (Erk2) (T185) Y187 и MAPK3 (Erk1) (T202) Y204 (Рисунок 2A-F). Известно, что активация канонической передачи сигналов TCR активирует каскад митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK), который последовательно активирует Ras, Raf и MEK ⁴⁵. MEK активирует MAPK1 и MAPK3 путем двойного фосфорилирования консервативного трипептидного мотива TxY ⁴⁶. Мы использовали фосфозит-специфическое антитело, которое распознает сайты двойного фосфорилирования MAPK1 и MAPK3, используя иммуноблоттинг, чтобы подтвердить количественный анализ наших протеомных данных (рис. 4A).Обнадеживает то, что количественное определение кратных изменений этих двойных фосфозитов с помощью иммуноблоттинга или протеомного анализа полностью согласуется друг с другом (рис. 4В). Данные выявили в значительной степени сопоставимые кратные изменения в сайтах активации MAPK1 и MAPK3 между Ab и OVA, вероятно, предполагая, что аналогичный MAPK-опосредованный путь активируется ниже ранней передачи сигналов ITAM между Ab и OVA. Соответствуя результатам по сайтам ITAM (рис. 3A), средние кратные изменения фосфозитов MAPK1 и MAPK3 для T4 и G4 коррелировали с их более низкой аффинностью связывания по сравнению с OVA (рис. 4B), что согласуется с предыдущим отчетом ²³.В целом, мы подтвердили количественную оценку наших протеомных данных в сайтах фосфорилирования MAPK1 и MAPK3 и выявили потенциальное сходство в нижестоящих сигнальных путях MAPK между антиген-независимыми Ab и антиген-специфическими OVA pMHC.

Рисунок 4:

(A) Иммуноблоттинг Erk1 (MAPK3) pThr202 / pTyr204 и Erk2 (MAPK1) pThr185 / pTyr187 фосфозитов и общих белков Erk1 и Erk3, действующих в качестве контроля загрузки. Показано репрезентативное изображение из 3 отдельных вестерн-блотов. (B) Количественное определение кратных изменений фосфозита MAPK1 и MAPK3 при иммуноблоттинге по сравнению с количественным определением по протеомным данным.DPBS использовали в качестве нестимулированного контроля для антитела (Ab), тогда как VSV использовали в качестве нестимулированного контроля для OVA, T4 и G4. Для количественного определения иммуноблоттинга интенсивность полосы для двойных фосфозитов как для MAPK1, так и для MAPK3 объединяли, усредняли и контролировали с помощью контролей загрузки, в то время как двойные фосфозиты для MAPK1 и MAPK3 количественно определяли отдельно для протеомных данных, как указано. Вестерн-блот проводился в трех экземплярах; протеомные данные были собраны в четырех повторностях. Полоса ошибок представляет собой стандартное отклонение среднего кратного изменения.

Фосфосит-центрический анализ сигнатурного обогащения с использованием PTM-SEA

Вместо индивидуального изучения каждого сайта pTyr, глобальный анализ фосфозита сайтов pTyr во всех условиях позволил бы более глубокую интерпретацию клеточной сигнализации, запускаемой различными активирующими агентами. Для достижения этой цели мы выполнили глобальный анализ путей с использованием анализа обогащения сигнатур PTM (PTM-SEA), построенного на базе данных модификаций для конкретных сайтов, таких как PhosphoSite Plus и NetPath ³⁸.PTM-SEA позволяет проводить анализ путей на уровне фосфоцентра, а не на уровне генов, чтобы лучше включать информацию о фосфозитах, а не только о генных продуктах, что идеально для набора протеомных данных pTyr. Используя методологию PTM-SEA для исследования сигнатур возмущений, мы обнаружили высокообогащенные сигнатуры пути анти-CD3 во всех условиях (рис. 5А). Положительная оценка обогащения указывает на корреляцию между аннотированным сайтом и категорией подписи, а отрицательная оценка указывает на антикорреляцию.Интересно, что путь анти-CD3, как известно, запускается многими активирующими Т-клетки антителами ⁴⁷, ⁴⁸, и это нарушение аналогично обогащается антиген-специфическими OVA, T4 и G4. Другие нарушения, обогащенные OVA и T4, такие как ванадат ⁴⁹, тромбин ⁵⁰, сложный эфир форбола ⁵¹, липополисахарид (LPS) ⁵², инсулин ⁵³, IL-2 ⁵⁴, были ранее подтверждены антителами. основанные исследования. Примечательно, что единственным нарушением с отрицательной оценкой обогащения для всех состояний является дазатиниб (рис. 5A), предположительно потому, что дазатиниб является селективным ингибитором рецептора тирозинкиназы, используемым для лечения хромового миелоидного лейкоза ⁵⁵, поэтому ожидается, что он будет иметь антикорреляцию с повышенное фосфорилирование тирозина при запуске TCR.PTM-SEA также выявил аналогичные наборы субстратов для киназ, обогащенных во всех условиях, особенно Zap-70 и Lck (рис. 5B). Тирозинкиназы Lck и Zap-70 известны как одни из первых киназ, которые активируются и рекрутируются в комплекс TCR при стимуляции Т-клеток ⁵⁶. Известные субстраты Lck или Zap-70 включают ITAM цепей CD3 и ζ (CD247), LAT и ITK, которые были идентифицированы с повышенной численностью в сайтах pTyr в этом наборе данных (рис. 2A-E). Интересно, что анализ с использованием базы данных NetPath сообщил об обогащении пути пролактина с тенденцией увеличения показателей, по-видимому, коррелирующей с силой антигенного сродства OVA, T4 и G4 (рис. 5C).Было обнаружено, что активация рецептора пролактина человека гормоном пролактина разделяет многие управляемые фосфорилированием сигнальные компоненты с активированными путями TCR ⁵⁷, ⁵⁸. Взятые вместе, широкомасштабное исследование всех сайтов pTyr с использованием PTM-SEA выявило в значительной степени сходное обогащение сигнатур между антиген-независимой и антиген-специфической активацией передачи сигналов Т-лимфоцитами.

Рисунок 5:

анализ сигнатурного обогащения PTM (PTM-SEA) всех сайтов pTyr по крайней мере с 3 из 4 каналов с поддающимися количественной оценке репортерными ионами в каждом состоянии сравнения.Подписанные значения q каждого сайта pTyr были упорядочены и использованы для вычисления оценки обогащения каждой категории сигнатур, которая, как известно, коррелирует с увеличением или уменьшением численности сайта pTyr на основе PTMsigDB. PTMsigDB содержит аннотацию каждого сайта pTyr с указанием направления регуляции в различных наборах сигнатур, полученных из сигнатур возмущений PhosphoSitePlus (A), сигнатур киназы-субстрата PhoshosSitePlus (B) и путей NetPath (C). Положительная оценка обогащения указывает на корреляцию между аннотированным сайтом и категорией подписи, а отрицательная оценка указывает на антикорреляцию.Серый прямоугольник означает, что не удалось рассчитать оценку обогащения для этой подписи, установленной при сравнении.

Дифференциальные сайты pTyr в Ab и OVA были аналогичным образом представлены в 25 ведущих путях KEGG

Для дальнейшей оценки того, согласуются ли пути, отражаемые дифференциально изменяющимися сайтами pTyr, с результатами PTM-SEA, приведенными выше, мы выполнили непараметрический анализ с использованием база данных альтернативных путей KEGG, использующая только сайты pTyr, которые были статистически значимыми (q <0.05) вместо всех сайтов pTyr. Аннотированные пути KEGG белков, содержащих дифференциальные сайты pTyr, были проанализированы и ранжированы-упорядочены для получения 25 основных путей KEGG, наиболее представленных дифференциальными сайтами pTyr (фиг. 6). Как и ожидалось, большинство этих путей KEGG были вовлечены в иммунную систему, такие как сигнальный путь TCR, цитотоксичность естественных клеток-киллеров, болезнь Шагаса и первичный иммунодефицит. Мы наблюдали, что количество дифференциальных сайтов pTyr было пропорционально одинаковым между Ab и OVA почти в каждом проанализированном пути KEGG, в то время как данные для OVA, T4 и G4, по-видимому, коррелируют с предсказанной силой аффинности соответствующих pMHC.В совокупности данные предполагают близкое сходство сигнальных путей, связанных с антиген-независимой стимуляцией Ab и высокоаффинной антиген-специфической активацией OVA TCR, а также демонстрируют чувствительность к различению между pMHC с более слабым сродством (T4, G4) и их сигнальный выход.

Рисунок 6:

Число значительно изменяющихся сайтов pTyr (q <0,05) в 25 основных путях KEGG, наиболее представленных этими дифференциальными сайтами pTyr во всех сравнениях в этом исследовании.

Белки сигнального пути TCR KEGG предполагают возможную отрицательную регуляцию в OVA

Для дальнейшего изучения белков, которые, как известно, участвуют в биологии Т-клеток, мы исследовали все сайты pTyr белков, которые участвуют в сигнальном пути TCR, как аннотировано KEGG. . Мы сравнили интенсивность кратного изменения в виде тепловой карты после выполнения иерархической кластеризации (рисунок 7). Подобные кластеры повышенных кратных изменений в сайтах pTyr наблюдались во всех условиях, особенно в канонических сигнальных белках TCR, таких как CD3D, CD3E, CD3G, CD247, ZAP70, LAT, MAPK1 и MAPK3.Мало того, что общие кратные изменения для высокоаффинного антигена OVA были самыми высокими среди всех условий, данные также включали статистически увеличенные сайты фосфорилирования Y536 и Y564 PTPN6 (SHP-1), которые не наблюдались в других условиях. Это примечательно, потому что PTPN6 представляет собой тирозинфосфатазу, которая негативно регулирует передачу сигналов Т-клеток, а фосфорилирование Y536 и Y564, как сообщается, коррелирует с увеличением активности фосфатазы ⁵⁹. В целом, данные предполагают в значительной степени схожий профиль в сайтах pTyr белков, участвующих в сигнальном пути Т-клеток KEGG, между антиген-независимой стимуляцией антител и антиген-специфической активацией TCR, но высокоаффинный OVA показал возможные признаки регуляции отрицательной обратной связи. из-за более сильного сигнального эффекта.

Рисунок 7:

Тепловая карта интенсивности изменения кратности (FC) всех сайтов pTyr, участвующих в пути передачи сигналов TCR, как обозначено KEGG. Иерархическая кластеризация была выполнена на основе расстояний между кластерами, соответствующих дендрограмме, показанной справа. Каждая строка представляет собой уникальный сайт pTyr, следующий за обозначением [имя_гена] _ [Y] [номер-остатка]. Сайты pTyr, происходящие от дважды фосфорилированных пептидов, помечены скобкой, содержащей второй сайт фосфорилирования с наивысшей вероятностью локализации.Сайты pTyr без скобок происходят от однократно фосфорилированных пептидов.

Обсуждение

В этом исследовании мы продемонстрировали полезность BOOST для получения новых биологических представлений путем сравнения pTyr-опосредованных сигнальных путей, запускаемых антиген-независимой стимуляцией Ab и антиген-специфической активацией Jurkat OT-1 TCR с использованием панели pMHC. тетрамеры (OVA, T4 и G4). Измененные пептидные лиганды G4 и T4 были отобраны, потому что было показано, что антиген G4 с низким сродством индуцирует положительный отбор, в то время как T4, как сообщается, является пороговым аффинным антигеном для индукции отрицательной селекции путем компартментализации передачи сигналов MAPK в тимоцитах мышей ²³.Включение канала повышения PV привело к глобальному увеличению количества мультиплексированных pTyr-содержащих пептидов (рис. S3A-D), что позволило избирательно запускать этот класс ионов-предшественников для фрагментации с помощью DDA, чтобы облегчить количественный анализ репортерных ионов в образцах интерес. Эта стратегия позволяет нам воспроизводимо количественно определить около тысячи сайтов pTyr вместе (рис. 2F) для анализа путей. Поскольку образцы были обогащены pTyr-содержащими пептидами до сбора данных на масс-спектрометре, вероятно, более целесообразно выполнить анализ путей с использованием базы данных сигнатур, ориентированной на PTM, такой как PTMsigDB ³⁸, а не с применением ген-ориентированного такой подход, как анализ обогащения генетического набора (GSEA).PTMsigDB предоставляет курируемые сигнатуры фосфорилирования пертурбаций, киназ и сигнальных путей, что является основой для сайт-специфической PTM-SEA, развернутой в этом исследовании. Интересно, что PTM-SEA обнаруживает близкое сходство в обогащенных сигнатурах между антиген-независимой и антиген-специфической активацией передачи сигналов TCR во всех условиях, поскольку не было особенно очевидного расхождения в путях передачи сигналов. В частности, сигнатуры возмущений, которые обычно были обогащены Ab, OVA, T4 и G4, такие как анти-CD3, ванадат и тромбин (рис. 5A-C), были ранее подтверждены в исследованиях на основе антител, направленных на TCR ^50–54, ⁵⁸.В целом, наши данные показывают, что активация TCR, запускаемая антиген-независимыми Ab или антиген-специфическим OVA pMHC, может иметь много общих компонентов передачи сигналов, опосредованных pTyr.

Помимо сходства сигнальных путей между Ab и антигенным pMHC, мы также наблюдали косвенные доказательства, которые, возможно, указывают на инициирование регуляции отрицательной обратной связи при сильной активации TCR высокоаффинным антигеном OVA, о чем свидетельствуют несколько известных негативных регуляторов TCR. передача сигналов, которые были дифференциально фосфорилированы, включая PTPN6, PAG1 и UBASh4A (Рисунок 2A, C, Рисунок 7).Во-первых, PTPN6 (также известная как тирозинфосфатаза SHP-1), как было показано, дефосфорилирует сайт активации инициирующей киназы Lck Y394, дестабилизируя ее активную конформацию и способствуя неактивному закрытому подтверждению как механизму подавления передачи сигналов Т-клеток ⁶⁰. Примечательно, что два тирозиновых сайта на С-конце PTPN6 (Y536 и Y564), которые были значительно усилены активацией OVA в наших данных (Рисунок 2C, Рисунок 7), как было показано, коррелируют с повышенной активностью фосфатазы при фосфорилировании этих сайтов ⁵⁹.Было предположено, что PTPN6 способствует отрицательной обратной связи передачи сигналов TCR путем ингибирования / конкуренции с регуляцией положительной обратной связи с помощью MAPK ⁶¹. Интересно, что сайты активации двойного фосфорилирования MAPK1 и MAPK3 OVA были примерно в 2 раза выше, чем T4 или G4, по нашим данным (Рисунок 4). Во-вторых, PAG1 был предложен в качестве негативного регулятора передачи сигналов TCR путем привлечения Csk для фосфорилирования ингибирующего тирозинового сайта Lck ⁶². Количественное фосфопротеомное исследование сообщило о петле отрицательной обратной связи, опосредованной SLP-76, регулируя фосфорилирование PAG1 Y227 ⁶³, и этот сайт pTyr был значительно увеличен при активации TCR, запускаемой OVA (рис. 2С).В-третьих, ранее сообщалось, что UBASh4A ассоциируется с E3 ubiquitin ligase CBL и подавляет передачу сигналов TCR посредством убиквитин-зависимого механизма ^{64, 65}, и мы наблюдали значительную активацию фосфозита UBASh4A Y3 в OVA-активированном образце. Интересно, что мы недавно обнаружили UBASh4A как один из проксимальных Lck-интеракторов при активации TCR с использованием Lck-TurboID близости с меткой ⁶⁶. Оба набора данных согласуются с нашей гипотезой о том, что Lck взаимодействует и фосфорилирует UBASh4A Y9 или способствует ассоциации другой тирозинкиназы с UBASh4A для фосфорилирования Y9, что делает возможным сборку аппарата убиквитинирования при деградации сигнального комплекса TCR.Расширение этого исследования, посвященного изучению временного эффекта уровней убиквитинирования в антигенах с высоким и низким сродством, может помочь проверить эту гипотезу. В совокупности наши данные предполагают возможные механизмы регуляции отрицательной обратной связи для ослабления передачи сигналов TCR после сильной стимуляции, индуцированной высокоаффинным антигеном.

Помимо выяснения механизмов сигнальных путей Т-клеток, анализ фосфозит-специфических путей потенциально может быть расширен для расширения нашего понимания механизмов заболевания.Например, в нашем анализе пути KEGG дифференциальные сайты pTyr в наших данных широко представлены при болезни Шагаса (рис. 6), вызванной паразитом Trypanosoma cruzi . Несмотря на то, что спустя более века после своего первоначального открытия, болезнь Шагаса (также известная как американский трипаносомоз) остается неизлечимой тропической болезнью и продолжает инфицировать миллионы людей во всем мире из-за загадочных причин, лежащих в основе инфекции ⁶⁷. Хотя известно, что пациенты с болезнью Шагаса содержат повышенные уровни провоспалительных цитокинов, высвобождаемых цитотоксическими Т-клетками CD8 + ⁶⁷, лежащий в основе молекулярный механизм все еще не полностью изучен.Подход BOOST может обеспечить основу для будущих исследований Т-клеток в контексте болезненных состояний Шагаса. Однако мы признаем, что клиническое применение возможно только в том случае, если будут проведены дополнительные валидационные исследования для тщательной проверки гипотез, созданных на основе этих протеомных данных.

Чтобы максимально повысить качество наших данных для осмысленной интерпретации данных, мы тщательно оптимизировали методологию BOOST, используемую в этом исследовании, учитывая многие аспекты во время до и после сбора данных.Во-первых, чтобы гарантировать, что изменения в изобилии сайтов pTyr являются стехиометрическими, а не из-за изменений в экспрессии белка, мы использовали одну и ту же (изогенную) клеточную линию для всего анализа, чтобы минимизировать вариации из-за клеточной гетерогенности между разными клеточными линиями. Мы также тщательно выполнили дополнительный этап нормализации перед объединением TMT на основе средней интенсивности каждого индивидуально меченого пептида, чтобы гарантировать, что стимулированные образцы и контроли были объединены в равных количествах. Что касается обозначения канала TMT, мы обозначили TMT126 как канал повышения PV, за которым следуют 2 пустых канала в TMT127N и TMT127C (рисунок 1C).После сбора данных мы подтвердили, что репортерное вмешательство канала повышения PV, возникающее из-за изотопных примесей 13C и 15N из реагента для метки, может четко наблюдаться, что приводит к ложным срабатываниям в пустых каналах (рисунок S3A-D). Включение этих холостых каналов помогло избежать утечки репортера в каналы образца, которая могла отрицательно исказить количественное определение репортерных ионов. Мало того, что не наблюдалась утечка +2 в TMT128N и TMT128C, репортерные интенсивности TMT128N и TMT128C также существенно не отличались от их соответствующих реплик (рис. S3A-D), что позволяет предположить, что репортерное вмешательство из канала повышения PV было ограничено утечкой +1. только в TMT127N и TMT127C.Хотя репортерная интерференция аналогичным образом может наблюдаться в PSM, отличных от pTyr, она более выражена в PSM, содержащих pTyr (рис. S3A-D). Возможно, что размещение пустых каналов минимизировало количественное искажение в исследуемых образцах, в результате чего среднее значение CV составляет менее 20% в pTyr PSM во всех условиях (рисунок S4). Это говорит о том, что точность и отбор образцов ионов при количественном определении репортерных ионов были достаточно хорошими по сравнению с исследованием протеомики отдельных клеток с использованием канала-носителя, где CV ≤20% был определен как точное количественное определение ⁶⁸.

Мы приписываем наблюдаемую высокую количественную точность среднему уровню повышения в 4–30 раз, специфичному только для pTyr-содержащих PSM (рисунок S5). Ожидается, что медианные уровни усиления положительно коррелируют с количеством пропущенных значений в репортерных каналах на pTyr PSM (рисунок S5). Это происходит потому, что мы предполагаем, что ионы PV имеют тенденцию непропорционально чрезмерно представлены в масс-анализаторе Orbitrap во время отбора проб с низким содержанием ионов в пробе, в то время как ионы с низким содержанием с большей вероятностью приведут к отсутствующим значениям из-за определенного порога отношения сигнал / шум. с помощью программного обеспечения для количественного анализа, такого как MaxQuant ⁶⁹.Кроме того, этот эффект повышения уровня специфичен только для pTyr PSM (рисунок S5). Уровень повышения от 4 до 30 раз полностью согласуется с рекомендацией недавнего исследования одноклеточной протеомики, предлагающего канал повышения носителя ~ 20X для оптимального отбора проб и минимальных эффектов коалесценции ионов или пространственной зарядки в приборах Orbitrap ⁶⁸. Недавняя оценка BOOST показала, что канал повышения PV отрицательно повлиял на количественную точность репортерных ионов из-за сильной степени сжатия, высокого CV% (до медианы 78%) и изотопной интерференции ⁷⁰ с использованием подхода количественного определения TMT на основе MS2.Однако известно, что количественное определение TMT на основе MS2 страдает от степени сжатия ⁷¹, и мы ранее показали, что вымышленные отношения близко совпадают с ожидаемыми значениями в нашем количественном анализе на основе SPS-MS3 ⁶. Здесь мы минимизировали влияние изотопных помех от канала повышения PV за счет стратегического размещения канала повышения PV в TMT126, оставив TMT127N и TMT127C пустыми. Мы дополнительно подтвердили нашу количественную оценку на основе протеомных данных путем прямого сравнения с обычным количественным анализом иммуноблоттинга и обнаружили устойчивое согласие между обоими методами (рис. 4).Мы попытались проверить другие сайты pTyr (такие как Zap70 Y493 и LAT Y220) с использованием других коммерчески доступных антител, но эти антитела могли обнаруживать только PV-обработанные образцы, содержащие большое количество сайтов pTyr на нефизиологических уровнях (рисунок S6). Это подчеркивает преимущества BOOST в преодолении ограничений использования фосфо-специфических антител для изучения клеточной сигнализации, управляемой фосфорилированием. Мы считаем, что оптимизированный дизайн BOOST, показанный в этом исследовании, свел к минимуму технические артефакты, которые могут отрицательно повлиять на количественный анализ, обеспечивая уверенность в интерпретации биологических представлений данных.

В заключение, наши данные предполагают, что pTyr-опосредованная регуляторная ось, запускаемая антиген-специфической активацией TCR OVA, очень напоминала антиген-независимую стимуляцию с использованием антитела против TCR, хотя OVA, вероятно, индуцировал относительно более сильный сигнальный эффект. Хотя данные этого исследования не отменяют предыдущие исследования передачи сигналов Т-клетками с использованием стимуляции на основе антител, наши данные выявили потенциальные преимущества использования тетрамеров pMHC при изучении передачи сигналов Т-клетками. Антиген-специфическая активация OT-1 TCR с использованием панели тетрамеров pMHC (OVA, T4 и G4) позволила получить данные, которые хорошо коррелируют с соответствующей аффинностью связывания pMHC, что согласуется с предсказанной силой передачи сигналов.Важно отметить, что очевидная корреляция между силой сигнала и сродством к pMHC позволяет нам точно настроить силу сигнала стимуляции Т-лимфоцитов в будущих исследованиях, позволяя более точно контролировать экспериментальный параметр вместо более бинарной активации на основе антител. Полезность BOOST также потенциально может быть экстраполирована на другие антиген-специфические TCR и широкий диапазон кинетики связывания, чтобы лучше понять механизмы взаимодействия TCR с опухолеспецифическими антигенами, представленными раковыми клетками.Мы признаем, что клиническое применение PTM-ориентированной протеомики все еще находится в зачаточном состоянии, но мы надеемся, что такие приложения со временем станут более осуществимыми, чему будет способствовать создание более качественных аннотаций PTM-ориентированных баз данных в синергии с геномными и протеомными исследованиями.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Рисунок S1: Иммуноблоттинг, исследующий общие уровни фосфорилирования тирозина в протеоме. Фигура S2: Гистограмма количества PSM, содержащих по крайней мере одну модификацию фосфорилирования по остаткам серина (S), треонина (T) или тирозина (Y), в зависимости от вероятности локализации фосфозита.

Рисунок S3: Общее количество поддающихся количественной оценке уникальных PSM, содержащих pTyr (A) и не содержащих pTyr (B), было указано для каждого канала TMT, включая пропуски (ложные срабатывания). Распределение log10 интенсивностей репортерных ионов уникального pTyr-содержащего (C) и не содержащего pTyr (D) PSM для каждого канала TMT показано на прямоугольных диаграммах.

Рисунок S4: Коробчатые диаграммы, иллюстрирующие распределение коэффициентов вариации в процентах (CV%) интенсивностей репортерных ионов для уникального pTyr-содержащего (слева) и не содержащего pTyr (справа) PSM для каждого состояния.

Рисунок S5: Медианные уровни усиления всех уникальных pTyr-содержащих и не pTyr-содержащих PSM нанесены на график как функция пропущенных значений во всех 8 возможных каналах репортерных ионов для каждого условия.

Рисунок S6: Иммуноблоттинг, исследующий фосфозиты с использованием фосфозит-специфических антител.

Файл S1: mqpar.xml (MaxQuant)

Файл S2: Интерактивная тепловая карта

Файл S3-S6: сценарии R

Файл S7: количественный анализ иммуноблота

Таблица S1: доказательства.txt (MaxQuant)

Таблица S2: Phospho (STY) Sites.txt (MaxQuant)

Таблица S3: Количественный анализ сайтов pTyr с аннотациями KEGG

Доступность данных

Данные масс-спектрометрии, протеомные данные были депонированы в Консорциум http: : //proteomecentral.proteomexchange.org) через партнерский репозиторий PRIDE ⁷² с идентификатором набора данных PXD024579.

Благодарности

Авторы выражают благодарность доктору Рики Эдмондсону и доктору Сэмюэлю Дж.Макинтошу из Университета медицинских наук Арканзаса (UAMS) за анализ протеомных образцов, доктору Аарону Стори из UAMS за любезное предоставление R-скриптов, используемых в анализе PTM-SEA, доктору Артуру Вайсу за любезное предоставление антитела C305 и доктору Ондрею Степанеку за создание клеточной линии J.OT1, использованной в этом исследовании. Все тетрамеры pMHC, использованные в этом исследовании (OVA, T4, G4 и VSV; задания 46336, 46338, 46339, 46340, соответственно) были получены через NIH Tetramer Core Facility (Атланта, Джорджия).Мы благодарим за финансовую поддержку грантов NIH R01AI083636, P01AI091580 и P20GM121293.

Низкомолекулярное ингибирование Csk изменяет распознавание аффинности Т-клетками

Чтобы определить, регулирует ли активность Csk порог активации TCR, мы стимулировали Т-клетки Csk ^AS CD4 ⁺ или Т-клетки CD4 ⁺ дикого типа (в качестве контроля специфичности) путем титрования антител к CD3ε в отсутствие или в присутствии высокой дозы ингибитора Csk ^AS, 3-IB-PP1, и исследовали события фосфорилирования тирозина, передающие сигнал проксимального TCR.Как было показано ранее, ингибирование только Csk ^AS индуцировало сильную активацию Lck, а также Fyn, на что указывало гиперфосфорилирование тирозинов их петли активации и сниженное фосфорилирование их ингибирующих тирозинов (Tan et al., 2014). Напротив, лигирование только TCR не изменяет детектируемого фосфорилирования Lck, что согласуется с более ранним сообщением (Nika et al., 2010). Поразительная активация Lck после ингибирования Csk ^AS была связана только с относительно слабым нижележащим фосфорилированием ZAP-70, LAT и PLC-γ1 (рис. 1A).Однако эта нижестоящая передача сигналов была очень сильно усилена, когда обработка ингибитором Csk ^AS была объединена с перекрестным связыванием анти-CD3ε, о чем свидетельствует заметное увеличение фосфорилирования ZAP-70, LAT и PLC-γ1 (рис. 1A). Чтобы определить, передавалась ли эта ранняя усиленная проксимальная передача сигналов дальше вниз по течению, мы исследовали фосфорилирование ERK1 / 2 (p-ERK). Величина p-ERK увеличивалась за счет ингибирования Csk ^AS дозозависимым образом 3-IB-PP1, с наибольшим усилением, наблюдаемым при использовании низкой дозы анти-CD3ε (рис. 1B).При высокой дозе анти-CD3ε повышенная интенсивность сигнала p-ERK, на что указывает небольшой сдвиг пика для клеток, обработанных 3-IB-PP1, может отражать более быстрый или более полный пиковый ответ в исследуемый момент времени. Примечательно, что одно только ингибирование Csk ^AS индуцировало лишь небольшое количество фосфорилирования белка ниже ZAP-70 (т.е. LAT и ERK1 / 2), вероятно, из-за ложной активации нескольких клеток (рис. 1A, B). Вместо этого ингибирование Csk ^AS синергетически со стимуляцией TCR, приводя к передаче сигналов ниже по течению.Наши данные убедительно свидетельствуют о том, что активность Csk играет решающую роль в установлении порога активации TCR. В частности, снижение активности Csk снижает порог активации сигнала и увеличивает чувствительность TCR.

Ингибирование Csk увеличивает величину индуцированной лигандом передачи сигналов TCR и снижает порог активации TCR.

( A ) Очищенные Т-клетки Csk ^AS (AS) или CD4 ⁺ дикого типа (WT), стимулированные в течение 2 минут 1 мкг / мл, 5 мкг / мл или 10 мкг / мл анти-CD3ε-антитела в присутствие ДМСО или 10 мкМ 3-IB-PP1 анализировали иммуноблоттингом на фосфорилирование тирозина петли активации Lck и Fyn (антитело Src pY416) и ингибирующего тирозина Lck (Lck pY505), фосфорилированного ZAP-70 (ZAP70 pY319). ), LAT (LAT pY132) и PLC-γ1 (PLCγ1 pY783), а также общий актин (контроль нагрузки).Данные представляют не менее трех независимых экспериментов. ( B ) Очищенные общие Т-клетки Csk ^AS (AS) или дикого типа (WT), стимулированные указанной дозой анти-CD3ε-антитела в течение 2 минут в присутствии ДМСО или 5 мкМ, 1 мкМ или 0,4 мкМ 3- IB-PP1 анализировали на фосфорилированную ERK (p-ERK) с помощью фосфопотока. Гистограммы регистрировали на клетках CD4 ⁺. Данные представляют не менее трех независимых экспериментов для клеток AS и двух независимых экспериментов для клеток WT.

https://doi.org/10.7554/eLife.08088.003

Было высказано предположение, что Csk играет важную роль в терминации сигналов TCR (Torgersen et al., 2001; Davidson et al., 2003). Для проверки этой модели мы исследовали динамику стимуляции Т-клеток Csk ^AS CD4 ⁺ анти-CD3ε антителом. Csk ^AS ингибирует пролонгированное фосфорилирование ZAP-70, LAT и PLC-γ1 (Рисунок 1 — приложение к рисунку 1A). Более того, все еще наблюдался четкий цифровой ответ на стимуляцию анти-CD3, который был усилен ингибированием Csk ^AS в самый ранний момент времени (Рисунок 1 — приложение к рисунку 1B).Были доказательства дозозависимой задержки 3-IB-PP1 в подавлении регуляции p-ERK, при этом подавляющая регуляция казалась более гетерогенной и, возможно, асинхронной по сравнению с цифровой повышающей регуляцией ответа (Рисунок 1 — приложение к рисунку 1B. ). Однако ингибирование Csk не предотвращало возможного ослабления сигнала с течением времени, указывая на то, что Csk играет лишь частичную роль в прекращении сигнала. Другие негативные регуляторные механизмы должны способствовать прекращению передачи сигналов TCR, хотя и более медленно в отсутствие Csk (Naramura et al., 2002; Ри и Вейлетт, 2012).

Чтобы изучить более физиологически релевантные регуляторные механизмы, индуцированные стимуляцией пептидом-MHC, мы генерировали мышей Csk ^AS, экспрессирующих трансген OTII-TCR овальбумин / MHCII-реактивный OTII (Fu et al., 2013; Salmond et al., 2014). Тетрамер использовался в качестве стимула для проведения подробных биохимических анализов, которые были бы невозможны с вмешивающимся вкладом белков из антигенпредставляющих клеток (APC). Стимуляция Т-клеток Csk ^AS; OTII CD4 ⁺ агонистическим тетрамером OVA pMHC во время ингибирования Csk ^AS приводила к заметно усиленному фосфорилированию ZAP-70, LAT и PLC-γ1 (рис. 2A) и приводила к увеличению и пролонгированное фосфорилирование ERK1 / 2 (рис. 2В).Таким образом, наши результаты с физиологическим лигандом OVA pMHC TCR аналогичны тем, которые используют анти-CD3ε, подтверждая, что Csk играет важную роль в установлении порога активации TCR и частично играет роль в терминации сигнала.

Ингибирование Csk снижает порог активации TCR и продлевает передачу сигналов, вызванных взаимодействием pMHC.

( A ) Очищенные Csk ^AS; OTII CD4 ⁺ Т-клетки, стимулированные в течение 3 минут 5 мкг / мл связанного с гранулами контрольного тетрамера pMHC или 5 мкг / мл, 2.5 мкг / мл или 1,25 мкг / мл связанного с гранулами тетрамера OVA pMHC в присутствии ДМСО или 10 мкМ 3-IB-PP1 анализировали иммуноблоттингом на фосфорилированные ZAP-70, LAT и PLC-γ1, а также на общий актин. (контроль загрузки). Данные представляют из трех независимых экспериментов. ( B ) Очищенные Csk ^AS; OTII CD4 ⁺ Т-клетки, стимулированные 5 мкг / мл связанного с гранулами тетрамера контрольного pMHC или 2,5 мкг / мл связанного с гранулами тетрамера pMHC OVA в течение 2, 5 или 10 мин в присутствие ДМСО или 5 мкМ 3-IB-PP1 анализировали на фосфорилированную ERK (p-ERK) с помощью фосфопотока.Гистограммы регистрировали на клетках CD4 ⁺ Vα2 ⁺. Данные представляют из трех независимых экспериментов.

https://doi.org/10.7554/eLife.08088.005

Чтобы оценить, оказывает ли пониженный порог активации TCR для проксимальных сигнальных событий после ингибирования Csk функциональное влияние на активацию нижележащих Т-клеток, мы отслеживали пролиферацию клеток Csk ^AS; Т-клетки OTII, стимулированные связанными с планшетом анти-CD3ε (рис. — рисунок, приложение 1A) или тетрамер OVA pMHC (рисунок 2 — рисунок, приложение 1B) в присутствии костимуляции анти-CD28.Каждый стимул титровали до доз, дающих от минимального до максимального ответа, поскольку антитело и тетрамер имеют разные молекулярные массы и физиологическую активность. В низких дозах и анти-CD3ε, и тетрамер pMHC OVA индуцировали большую клеточную пролиферацию, когда ингибировался Csk ^AS, что согласуется с повышенной величиной проксимальной передачи сигналов TCR. Следовательно, контролируя активность Csk, можно модулировать порог передачи сигналов TCR и результирующих ответов.

Затем мы исследовали, какое количество возмущений Csk и Lck необходимо, чтобы вызвать физиологические изменения в ответе Т-клеток.Здесь мы использовали Csk ^AS -экспрессирующие Т-клетки CD8 ⁺ или трансгенные Т-клетки CD8 ⁺ с OTI TCR, специфичными для комплекса пептид OVA / MHC класса I. Титрование 3-IB-PP1 в Т-клетках Csk ^AS CD8 ⁺ выявило максимальное трех- или четырехкратное усиление Lck pY394, которое коррелировало с повышенной активностью Lck (рис. 3A) (Chakraborty and Weiss, 2014). Таким образом, в состоянии покоя 25–33% Lck фосфорилировалось по Y394, что согласуется с некоторыми предыдущими оценками (Nika et al., 2010) и выше других (Ballek et al., 2015). Следует отметить, что это только вывод из плато с высокими дозами лекарств. Это исследование не предназначено для оценки процента активного Lck в базальном состоянии, поскольку некоторые Lck могут быть недоступны для активации посредством ингибирования Csk. Низкие дозы 3-IB-PP1 (1 мкМ или меньше) вызывали максимум 50% -ную активацию pY394, тогда как дозы 5-10 мкМ вызывали трех- или четырехкратную активацию. Неожиданно, фосфорилирование ингибирующего хвоста Y505, прямой мишени Csk, не снижалось так заметно.Это наблюдение предполагает, что Lck активно фосфорилируется с помощью Csk, но значительная часть pY505 либо недоступна для дефосфорилирования с помощью CD45, либо дефосфорилируется в течение более длительного периода времени. Это, однако, не объясняет, как небольшое снижение pY505, особенно в CD8 ⁺ Т-лимфоцитах, приводит к большому увеличению pY394.

Слабое ингибирование Csk и активация Lck усиливают передачу сигналов агонистов.

( A ) Csk ^AS CD8 ⁺ Т-клетки отдыхали и стимулировали указанными дозами 3-IB-PP1 в течение 3 минут, лизировали и подвергали иммуноблоттингу для активации (pY394) и ингибитора (pY505) фосфорилирования Lck. . Ниже приводится количественная оценка (± sem) трех независимых экспериментов иммуноблота. ( B ) Csk ^AS; OTI наивные CD8 ⁺ Т-клетки отдыхали, стимулировали BSA, связанный с гранулами, или 10 мкг / мл pMHC-OVA в течение 3 минут, лизировали и анализировали с помощью иммуноблоттинга.Данные представляют как минимум два независимых эксперимента.

https://doi.org/10.7554/eLife.08088.007

Мы исследовали, оказывает ли ингибирование Csk дифференциальное воздействие на CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки. Однако мы обнаружили, что CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки имеют идентичные ответы на ингибирование Csk при нормализации их базального уровня фосфорилирования Lck (рисунок 3 — приложение к рисунку 1).Интересно, что CD8 ⁺ Т-клетки экспрессируют на ~ 15% больше Lck (Olszowy et al., 1995) и имеют более высокое (~ 20%) базальное количество ингибирующего хвостового фосфорилирования pY505. Как в Т-клетках CD4 ⁺, так и в CD8 ⁺, pY394 увеличивался гораздо более заметно, чем связанное с ним снижение pY505 в ответ на низкие дозы ингибитора Csk. Молекулярный механизм этого ответа неизвестен. Одна из возможностей рассмотрения состоит в том, что даже небольшой пул активных Lck, который дефосфорилируется по Y505 и становится фосфорилированным по Y394, обеспечивает трансавтокаталитический механизм, который может усиливаться в более крупном пуле молекул Lck, которые не фосфорилируются по pY394.Интересно, что также было замечено, что стимуляция антителами против TCR и CD4 приводит к значительному увеличению pY394 без значительной потери pY505 (Ballek et al., 2015).

Краткосрочная стимуляция Csk ^AS; OTI CD8 ⁺ Стимуляция Т-клеток связанным с гранулами тетрамером OVA-MHC усиливалась даже при низких уровнях ингибирования Csk (<1 мкМ) (рис. 3B), что демонстрируется степенью Фосфорилирование PLC-γ1 и ERK1 / 2. При этой дозе ингибитора Lck pY394 не увеличивался более чем на 50%, указывая на то, что даже незначительные изменения активности Lck могут усиливать проксимальную передачу сигналов.Более высокие дозы ингибитора еще больше усиливали передачу сигналов Lck, предполагая, что активность Csk и Lck можно титровать в широком диапазоне.

Lck не только инициирует TCR-зависимую передачу сигналов, но также считается важным привратником в моделях кинетического корректурного считывания, которые пытаются объяснить изящную аффинную дискриминацию Т-клеток агонистов с лишь немного разными периодами полураспада (Палмер и Нахер , 2009; Степанек и др., 2014). Мы предположили, что гиперактивация Lck может по-разному регулировать сильные и слабые агонисты.Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали панель хорошо охарактеризованных измененных пептидов OVA (Daniels et al., 2006). Когда Т-клетки Csk ^AS; OTI CD8 ⁺ стимулировали APC, предварительно загруженные пептидами с различной агонистической активностью во время сильного ингибирования Csk ^AS (5 мкМ), мы наблюдали заметное увеличение экспрессии CD69 в ответах на слабые (T4, Q4H7, G4), контрастируя лишь с небольшим усилением ответов на сильные (OVA, Q4R7) агонисты (рис. 4A). Хотя OVA-ответ не был полностью насыщен в этот ранний момент времени (4 часа), он был лишь слегка усилен сильным ингибированием Csk.При стимуляции OVA, но не измененными пептидами, TCR быстро подавляется из-за его фосфорилирования и удерживания во внутриклеточных везикулах (Cai et al., 1997). Одно только ингибирование Csk индуцировало некоторое лиганд-независимое подавление TCR, но дополнительное подавление наблюдали со всеми пептидами, даже с самым слабым G4, что свидетельствует об изменении передачи сигналов низкоаффинных пептидов на очень восходящей стадии (Рисунок 4 — рисунок в приложении 1). Важно отметить, что APC, нагруженные нулевым агонистом VSV, не вызывали подобной активации или подавления TCR, демонстрируя, что ингибирование Csk работает строго синергетически с родственным лигандом TCR.Более того, хотя APC, происходящие из селезенки, все еще должны представлять эндогенные самопептиды, только загрузка родственных пептидов приводила к устойчивой активации Т-клеток после ингибирования Csk.

Ингибирование Csk усиливает ответ на слабые агонисты.

( A ) Csk ^AS; OTI наивные CD8 ⁺ Т-клетки стимулировали обработанными MitoC спленоцитами WT, предварительно загруженными указанными пептидами, в присутствии DMSO или 5 мкМ 3-IB-PP1 в течение 4 часов и CD69 положительную регуляцию измеряли с помощью проточной цитометрии.( B ) Csk ^AS; OTI наивные CD8 ⁺ Т-клетки стимулировали, как в A , различными дозами 3-IB-PP1 с подгонкой доза-ответ. ( C ) EC50 3-IB-PP1 (нМ) для% CD69 положительных клеток для данных в B . Данные представляют два независимых эксперимента.

https://doi.org/10.7554/eLife.08088.009

Мы предположили, что поразительное усиление распознавания слабого агониста связано с сильным ингибированием Csk и активацией Lck (трехкратное при 5 мкМ 3-IB-PP1).Чтобы проверить степень ингибирования Csk, необходимую для усиления передачи сигналов слабых агонистов, мы титровали 3-IB-PP1 и анализировали ответы на слабые агонисты Q4H7 и G4 (рис. 4B). Неожиданно мы наблюдали дозозависимое усиление передачи сигналов при 100–1000 нМ 3-IB-PP1, где увеличение Lck pY394 было слабо выявляемым и не более чем на 50% превышало базальный уровень. За пределами этой дозы ингибитора мы наблюдали эффект насыщения, несмотря на более низкое общее плато при более низкой дозе пептида. Таким образом, относительно слабой гиперактивации Lck было достаточно для усиления распознавания слабых агонистов.Нижнее плато предполагает, что существуют независимые от Csk механизмы определения дозы агониста. Примечательно, что концентрация EC50 ингибирования Csk для активации CD69 все еще зависела от качества и дозы агониста (фигура 4C). При более низкой дозе агониста более слабый пептид G4 требовал вдвое больше 3-IB-PP1, чем Q4H7. Точно так же ЕС50 зависела от дозы пептида. Эти наблюдения доказывают, что ингибирование Csk регулирует ответ на дозу агониста и определение аффинности периферических Т-клеток.

Рыбакин Артур Владимирович, 외과 의사, Санкт-Петербургский институт красоты 의 수석 의사

Рыбакин Артур Владимирович 는 전설 적인 인물 입니다. 그의 이름 에는 소문 이 너무 많고, 수백만 명의 여성들 이 그 와 약속 을 잡는 꿈 을 꿉 니다. 그는 스타 의 외과 의사 이며, 우리 무대 의 많은 유명인 들이 한번 언급 했습니다. 작업 을 수행 하는 광대 한 경험 은 이 의사 를 대부분 보다 머리 위로 올려 놓습니다. Рыбакин Артур Владимирович 는 지난 20 년 동안 하루 에 최대 3 회의 작업 을 수행 합니다.

그러한 성과 를 반복 할 수 있는 의사 를 찾는 것은 어렵 습니다. 그는 비 성형 전문의 들 사이 에 자부심 을 가지고 있습니다. 오늘날 코 의 모양 을 수정 하는 것이 가장 인기 있는 절차 입니다. 그 외에는 얼굴 특징 을 바꿀 수 없기 때문 입니다.길이 를 약간 줄이거 나 날개 의 너비 를 접어 넣으면 오랜 동안 기뻐할 완전히 새로운 이미지 를 얻게 됩니다.

혁신 자

Рыбакин Артур Владимирович 는 저렴한 서비스 를 제공 할 수 없는 최고의 전문가 입니다. Ринопластика 는 벤치 마크 입니다. 이 전문가 의 이름 은 가계 이름 이 되었습니다. 그가 개발 하고, 완벽 하게 만들고, 성공적 으로 적용한 모든 방법, 기법 및 기법 은 단일 일관된 시스템 으로 통합 됩니다. 오늘날, 그녀 는 고객 뿐만 아니라 그녀 를 젊은 전문가 들 로부터 많은 팬 들을 확보 하고 있습니다.

교육

Рыбакин Артур Владимирович 는 대학 에서 숙달 의 길 을 시작 했습니다. И.П. Павлова. 평생 교육 은 임상 거주 였습니다. 지식 지식 은 전문 직업 을 시작 하기 에 충분 했습니다. 작업 과정 에서 여전히 많은 기술 세미나 과학 때문에 기술 을 연마 하고 새로운 기술 을 배우는 물론 자신 의 저자 솔루션 을 만들 수 있었습니다.외과 의사 Артур Рыбакин 은 러시아 최고의 성형 외과 의사 로 간주 됩니다.

과학적 활동

그가 오늘 의 높이 에 도달 하기 전에 Рыбакин (그 당시 거의 경험 이 없는 성형 외과 의사) 은 과학적 연구 에 적극적 으로 참여 하기 시작 했습니다. 1994 год 년 부터 그는 실용적인 경력 을 쌓기 시작 했습니다. 1997 г. 부터 그는 성형 외과 학부장 을 역임 했습니다. 1998 год 년 에 최초 의 실용적인 학술 대회 가 개최 되어 라 포터 로서의 연설 을 했습니다. 화장품 의 화제 는 의제 에 있었다. Рыбакин 의 보고서 는 얼굴 과 목 의 회춘 수술 에 전념 했습니다.

1999 년 성형 외과 및 미용 에 관한 두 번째 별 개최 되었습니다. 이번에 그의 연설 은 청중 의 관심 을 불러 일으킨 새로운 유망한 했다.

2001 년 부터 그의 스타 경력 이 시작 됩니다. Рыбакин 은 Санкт-Петербургский институт красоты 에 초대 되어 주치의 의 직책 을 맡고 있습니다.

외과 의사 는 얼굴 과 몸 을 복구 하고, 교정 하고, 젊어 지게 하는 수술 을 전문 으로 합니다. 당신 이 А.В. Рыбакин 의 환자 라면, 당신 은 그의 지도력 하에 있는 수준 을 잘 알고 있습니다.

완벽한 얼굴

환자 가 성형 외과 의사 를 지칭 하는 것이 대부분 입니다. СПИК (Санкт-Петербургский институт красоты) 는 놀라운 작품, 창조물 또는 예술 작품 으로 유명 합니다. 이것은 Рыбакин Артур Владимирович 가 일하는 주된 방향 입니다. 환자 는 이 외과 의사 에게 정확하게 전달 되기 위해 몇 개월 동안 기록 됩니다.

진료소 는 다음 과 같은 분야 를 구분 합니다.

노화 방지 수술;
중재, 그 목적 은 개별 얼굴 특징 을 변경 하는 것 입니다.

이러한 절차 및 기타 절차 는 함께 수행 되거나 별도로 수행 될 수 있습니다.그것은 모두 환자 의 욕구 와 능력 에 달려 있습니다. 최근 까지 성형 외과 의사 의 목표 는 깊은 주름 을 줄이는 것이 었 습니다. 이렇게 하기 위해, 피부 는 위로 움직 였고, 동시에 그 초과분 은 해부 되었습니다. 오늘날 이 방법 은 쓸모 없는 것으로 간주 됩니다. Рыбакин А. В. 는 최신 생체 외 모양 형성 기술 을 사용 합니다. 이것은 깊은 조직 의 회춘 의 개념 으로, 결과적 으로 환자 의 외부 상태 가 개선 됩니다. 연령 과 관련된 변화 는 피부 뿐 아니라 피하 조직 및 구조 에도 영향 을 줍니다. 그 결과 성형 외과의 가 일하는 심부 조직 의 복합체 에서 조직 과잉 이 발생 합니다.

노화 방지 수술

오늘 우리 는 그의 분야 에서 가장 유명한 전문가 에 이야기 하고 있습니다. Рыбакин А. В 내시경 기술 을 적극적 으로 사용 합니다. 이것은 아직 대부분 의 외래 교정 클리닉 을 꿈꾸지 못한 미래 로 걸음 입니다. 이 기술 덕분 에 긴 커팅 을 포기 하고 사용 가능한 미니어처 통해 작업 을 수행 할 수 있게 되었습니다.눈 에 띄는 흉터 는 없지만 전문가 의 활동 영역 을 제한 하지는 않습니다. 이 방법 의 두 번째 장점 은 조직 손상 의 감소, 회복 기간 의 감소 및 출혈량 감소 입니다.

곡예 비행

미적 수술 의 최신 경향 은 조직 공학 의 도입 입니다. 그리고 연구소 의 수석 전문가 인 Рыбакин А.В. 는 러시아 에서 처음 으로 광범위 하게 사용 되었습니다. 줄기 세포 이식 은 완전히 새로운 차원 의 서비스 제공 을 가능 하게 했습니다. 현대 화장품 은 이 혁신 이 없으면 달라질 것 입니다. 볼륨 의 부족 을 채우기 위해 신체 에서 지방 이나 연골 조직 을 가져갈 필요 가 없다는 주목 사실 입니다. 이를 위해 실험실 에서 재배 됩니다.

Институт красоты 에서 의 조직 공학 방법 은 아주 잘 뿌리 를 내리고 있습니다. 성장한 조직 은 완전히 안전 하고 거부 를 하지 않으며 없이 외형 을 시뮬레이션 할 수 있습니다. 이 목적 을 위해 실리콘 및 기타 인공 를 먼저 항상 염증 과정 의 위험 이 있습니다.오늘날 볼륨 의 채우기 가 실제로 당신 의 생물학적 자료 이므로 완전히 제외 됩니다.

저자 의 기술

성형 외과의 가 얼굴 을 완벽 하게 보이게 하기 위해 사용 하는 기술 에 대한 몇 마디. Рыбакин В. А. 은 놀라운 결과 를 내는 자신 의 계획 을 가지고 있습니다. 첫 번째 는 눈 근처 의 연령 관련 징후 를 없애는 것 입니다. 이러한 조작 을 통해 수평 폴드 를 제거 하고 상 눈꺼풀 을 보이게 할 수 있습니다. 눈 바깥 쪽 모서리 에 물방울 이 кантопексия 가 수행 됩니다. 이 절차 를 통해 표정 이 표현 적이고 매력적 이 됩니다.

중층 면 의 회춘 은 비 성형술 (скуловые контуры) 과 비 성형술 (блефаропластика) 의 성형술 및 모델링 으로 시작 됩니다. 완벽한 결과 를 얻기 위해 외과 의 사는 뺨 의 모양 을 눈물 을 줄 입니다. 이 분야 에서 그는 내시경 기술, 조직 공학 의 업적 으로 적극적 으로 도움 을 받았습니다.

아래 부분 회춘 은 또 다른 복잡한 절차 집합 입니다.아름다운 외형 을 형성 하기 위해 성형 외과 의사 (Санкт-Петербург) 가 SMAS — Платизмопластика 를 실시 합니다. 이것이 충분 하지 않으면, 그는 두 번째 턱 지방 흡입술 에 수 있습니다. 따라서 그의 작품 에서 노화 방지 기술 은 특징 을 바꾸는 과 밀접 하게 연관 되어 있음 을 알 수 있습니다.

스타 환자

TV 화면 에서 아름다운 여성 과 남성 을 드레스 로 보고, 완벽한 모양 으로 보았을 때, 자연 자체 가 인기 위해 모든 것을 주었다고 합니다. 사실, 모든 것이 그렇게 간단 하지 않습니다. 전문 헤어 스타일 및 메이크업, 정기적 인 미용 절차 가 이미지 생성 에 영향 을 미치지 만 그 전부 는 아닙니다. 대부분 의 현대 팝 스타 들은 СПИК 를 방문 하여 Рыбаков 가 변형 시켰 습니다. Алла Пугачева, Кристина Орбакайте, Кэти Топурия — 성형 외과 의 사와 함께 변화 의 길 을 겪었 습니다.이 목록 은 거기서 끝나지 않고 무기한 으로 계속 될 수 있습니다. 그들 중 일부 는 공개적 으로 그가 플라스틱 을 만들었고 다른 사람들 은 그것에 대해 침묵 을 를 선호 한다고 말한다. 그러나 그들이 모두 한 명의 외과 의사 를 선택 했다는 사실 은 말해 줍니다.

완벽한 몸

Санкт-Петербургский институт красоты 와 수석 전문가 인 Рыбакин А.Б. 는 우아한 실루엣 을 창조 하고 인물 을 개선 하며 조화 로운 비율 을 조성 위한 절차 를 제공 합니다. 전통적 으로, 그것들 모두 는 감소 와 증가 로 나눌 수 있습니다. 고객 의 희망 에 따라 외과 의사 는 초과 조직 을 부피 부족 을 보완 합니다.

미적 수술 의 클리닉 은 교정 구역 에 따라 환자 에게 다양한 종류 의 성형 수술 제공 합니다. 전문가 의 실제 적인 목적 이 이해 가 안되기 때문에, 우리 는 단지 가장 기본적인 것을 간략 하게 기록 합니다. 이 маммопластика, ягодичная пластика 및 기타 여러.

복잡한 것에 대해서

각 방법 은 단일 수술 이 아니라 전문의 가 전문적 으로 사용 하는 수술 방법 의 복합체 입니다. 오늘날, «지방 성형술 (липопластика)» 이라는 절차 는 점점 더 많은 인기 를 얻고 있습니다. 즉, 지방 조직 의 이식 을 통해 신체 윤곽 을 모델링 하는 것 입니다. 우리 는 미적인 결과 가 주로 기술 아니라 의사 기술 과 경험 에 달려 있다는 사실 잊어서 는 안됩니다. 수백 가지 방법 중에서 그는 당신 에게 이상적인 방법 을 선택 해야 합니다. 그러나 자신 을 위해 진료소 와 의사 를 선택 하지 않았다면 СПИК (Санкт-Петербургский институт красоты) 에 주의 하십시오. 그것은 당신 을 실망 시키지 않을 최고의 솔루션 을 제공 할 것 입니다.

친밀한 플라스틱

적극적 으로 발전 하고 있는 젊은 방향. СПИК 센터 의 성형 외과 (СПБ) 는 이미 미적 기능적 변화 를 제공 할 수 있는 수준 에 이르렀 습니다.Рыбаков А. В. 가 수행 한 주요 작업 유형 을 살펴 보겠습니다.

Лабиопластика 는 외부 생식기 의 미학 입니다. 환자 의 요청 에 따라 음순 음순 과 음순 이 축소 되거나 수 있습니다.
대장 내시경 은 질의 양 이 감소 합니다. 벽 을 지나치게 늘리면 성생활 의 질 이 될 뿐만 아니라 소변 기 질 시스템 의 건강 에도 영향 을 미칩니다.
G 포인트 증가 는 히알루 론산 주입 으로 수행 되는 또 다른 트렌디 한 절차 입니다. 고통 스럽지 만 짧은 절차 로 인해 다음 과 같은 효과 가 발생 합니다. 점막 부피 의 증가 는 과민성 구역 의 활성화 로 이어 지며 으로 질의 성교 시 감각 이 증가 합니다.

요약 하면 성형 외과 의사 의 선택 은 매우 중요한 단계 라고 말하고 싶습니다. 전문가 는 싸울 수 없으므로 건강 을 지키려고 하지 마십시오. 리뷰 를 분석 한 결과, 우리 가 외모 를 바꾼다 면 Артур Владимирович 는 자신 의 욕구 를 정확하게 하고 건강 에 해 를 끼치 지 않는 방법 알고 있다고 결론 을 내 렸습니다.

Клиника Галактика в Москве, Россия

Пластическая хирургия

Коррекция ареолы (без белья)

Грудные имплантаты

Увеличенный доступ груди в складку под грудью

Увеличенный доступ груди в подмышечной впадине

Увеличенный доступ ареолы молочной железы по краю

Увеличение груди без переплат

Коррекция ареолы с увеличивающей маммопластикой

Реконструкция груди

Односторонняя реконструкция груди

Односторонняя реконструкция груди с установкой имплантата на имплантате с установкой имплантата на груди здоровье груди

Двусторонняя реконструкция груди

Уменьшение груди

Уменьшение груди классическим способом

Уменьшение груди периареолярным путем

Уменьшение груди минимально инвазивным способом

Вертикальное уменьшение груди

Уменьшение груди без переплаты

Уменьшение груди путем липосакции 927 9

0 3 (гинекомастия) омоложение лба

Увеличение ягодиц с помощью имплантатов

Chin Implant

Уменьшение подбородка

Блефаропластика

Операция по омоложению верхних век под местной анестезией

Операция по омоложению верхних век под общей анестезией

Операция по омоложению верхнего и нижнего века

Блефаропластика верхних век без переплат

Операция по омоложению лица и шеи

Подтяжка лица

Омоложение верхних 2/3 лица

Операция по омоложению лица

Омоложение середины 909

SMAS нижних 2/3 лица

Лабиопластика

Уменьшение и коррекция формы малых половых губ (с одной стороны)

Уменьшение больших половых губ (с одной стороны)

Увеличение больших половых губ (с одной стороны)

Операция по изменению контуров губ

Липосакция

Липосакция живота

Липосакция живота без переплат

Коррекция внешней части бедра с помощью липосакции

Липосакция бедра без переплат

Коррекция внутренней части бедра липосакцией

Уменьшение ягодиц путем удаления лишнего жира (липосакция)

Липосакция ягодиц без переплат

Операция по омоложению шеи

Отопластика

Коррекция эквидистантности ушной раковины

Коррекция эквидистантности Консультации обоих ушей

9028

Ринопластика

Изменение кончика носа

Пластика живота

Абдоминопластика

Абдоминопластика без переплат

Мини-абдоминопластика

Миниабдоминопластика

Миниабдоминопластика без переплат

Консультация сужения влагалища

3

Медицинская коррекция промежности

928 927 Медицинская коррекция промежности Удаление родинки

Удаление бородавок 0.5 см2

Silhouette Lift

Нитки Silhouette Lift Soft — 16 конусов — 2 нити

Нити Silhouette Lift Soft — 12 конусов — 2 нити

Нитки Silhouette Lift Soft — 8 конусов — 2 нити

Волосы Лечение выпадения

Консультация специалиста по выпадению волос

Лечение выпадения волос

Мезотерапия кожи головы INNO TDS Выпадение волос (1.5 мл)

Мезотерапия кожи головы Mesoline Hair (5 мл)

Процедуры в салоне красоты

Лазерная эпиляция

Верхняя губа

Список новых книг

Этот список обновляется каждый четверг. Заголовки расположены в порядке номеров звонков.
Чтобы просмотреть предыдущие списки, посетите нашу страницу архивов.

Телефонный номер	Название	Издатель
D16.14 .B38 1977	Расшифровка и редактирование устной истории / Уилла К. Баум.	Нэшвилл: Американская ассоциация государственной и местной истории, c1977.
E78.C15 h56 1972	Шахты и карьеры индейцев Калифорнии [авторы] Роберт Ф. Хейзер и Адан Э. Треганза.	Рамона, Калифорния, Ballena Press, 1972.
E885 .O38 1997	Я должен вам нарисовать картинку? / Джек Оман Предисловие Стива Келли.	Гретна, Ла.: Пеликан, 1997.
F787 .G55 2005	Маркировка тропы: сто лет управления культурными ресурсами / составлено Дэвидом А. Гиллио.	[Альбукерке, Нью-Мексико?]: Департамент сельского хозяйства США, Лесная служба, Юго-Западный регион, [2005]
F871 .O7 v.24 no.4	Подробнее об асторианах / Стелла М. Драмм.	Юджин, Ор. : Koke-Tiffany Co., 1923.
F871 .O7 v.41 no.3	Лагеря Джедедайи Смита на побережье Орегона.[Салем, штат Орегон, 1940.	Арката, Калифорния, библиотека, Государственный колледж Гумбольдта, 1967]
F876 .K43 2001	Книги и печатные издания Восточного Орегона: аннотированная и историческая библиография / Уэйн Ки.	Prineville, Or. : Паунина [т.е. Паулина?] Пресс, 2001.
F882.H85 A78 1998	Timberline и век лыжного спорта на горе. Худ / Жан Артур с фотографиями Рэя Аткесона и Хью Экройда.	Whitefish, Mont.: Издания Whitefish, 1998.
G131 .D38 1992	Не очень разбираюсь в географии: все, что вам нужно знать о мире, но вы так и не узнали / Кеннет С. Дэвис.	Нью-Йорк: У. Морроу, c1992.
GV199.42.O72 C371 1982	Тропы Калапуйи / Джерольд Уильямс.	Юджин, Ор. : Calapooya Books, 1982.
HD9757.O7 P655 1989	Вендлинг, Орегон, лесозаготовительные лагеря, 1898-1945 гг. / Луи Э.Полли.	Маркола, Ор. : Polley Pub., [1989]
HD9759.S585 S66 1990	Родословные: столетняя история Симпсона / Роберт Спектор.	Белвью, Вашингтон: Documentary Book Publishers Corp., 1990.
NC1429.H78 G73 1989	Лучшие хиты Хорси 80-х: в том числе лучшая песня Бумеров / Дэвида Хорси.	Сиэтл, Вашингтон: Сиэтл Пост-Интеллигенсер, c1989.
PN6231.F62 O36 1988	Страх перед ловлей рыбы нахлыстом / Джек Охман.	Нью-Йорк: Саймон и Шустер, c1988.
QE75 .B9 № 2024	Краткие статьи по палеонтологии и стратиграфии, 1992 / под редакцией Уильяма Дж. Сандо.	[Рестон, штат Вирджиния?]: Департамент внутренних дел США, Геологическая служба США, Денвер, Колорадо: Продается по книгам и отчетам о продажах в открытых файлах, 1993.
QE75 .B9 no.2025	Руководство по разработке и применению географических информационных систем для анализа осадочных бассейнов: тематическое исследование бассейна Сан-Хуан, Нью-Мексико и Колорадо / Бетти М.Миллер.	Вашингтон, округ Колумбия: США G.P.O. Денвер, Колорадо: Продается в книгах и отчетах о продажах в открытых файлах, Геологическая служба США, 1992.
Qh41.M78 S88 1995	Сердце мира Джона Мюра: Висконсин, семья и открытие дикой природы / Милли Стэнли.	Мэдисон, Висконсин: Prairie Oak Press, c1995.
QH541.5.F6 I94 2006	Протоколы IUFRO Div. 4 Международное совещание 2006 г. [электронный ресурс]: управление лесными экосистемами: проблемы изменения климата: Университет Вальядолида в Паленсии, Испания, 3-7 апреля 2006 г.	[Вальядолид, Испания: CuatroElementos], 2006.
QP82.2.I53 K65 1993	Воздействие на здоровье низкоуровневой радиации / Сохей Кондо.	Осака, Япония: Kinki University Press Madision, WI, США: Medical Physics Pub., C1993.
QP501 .B53 no.75	Структура и функция в клеточной адгезии / организовано и отредактировано Дэвидом Гарродом.	Лондон: Portland Press Ltd, c2008
QP501.S8 v.48	Семейство белков коронина / под редакцией Кристофа С. Клемена, Людвига Эйхингера, Василия Рыбакина.	Нью-Йорк: Спрингер Остин, Техас: Landes Bioscience, c2008.
RA569 .R44 1976	Отчет о применимости международных рекомендаций по радиационной защите в странах Северной Европы / [под ред. Б. Линделла опубл. от] институтов радиационной защиты в Дании, Финляндии, Исландии, Норвегии и Швеции.	[Стокгольм: LiberForlag / Allmanna forl.], 1976.
RA1231.R2 I59 1966	Радиационная защита. Оценка рисков, связанных с радиацией: отчет / подготовлен для Комитета I Международной комиссии по радиологической защите и получен Комитетом 20 апреля 1965 года.	Оксфорд [Англия] Нью-Йорк: Опубликовано для Комиссии Pergamon Press, 1966 .
RA1231.R2 R4 1959	Радиационная защита. Рекомендации Международной комиссии по радиологической защите (приняты 9 сентября 1958 г.).	Нью-Йорк: Опубликовано для Комиссии издательством Pergamon Press, 1959.
RA1231.R2 R4 1964	Радиационная защита. Рекомендации Международной комиссии по радиологической защите (с поправками 1959 г. и пересмотренными в 1962 г.).	Оксфорд [Англия] Нью-Йорк: Опубликовано для Комиссии издательством Pergamon Press, 1964.
RA1231.R2 R4 1966	Рекомендации Международной комиссии по радиологической защите (приняты 17 сентября 1965 г.).	Оксфорд: Pergamon Press, [1966]
SD127 .A76 1994	Вид сверху: Исследование Лесной службы / Р. Кейт Арнольд, М. Дикерман, Роберт Э. Бакман под редакцией Гарольда К. Стина.	Дарем, Северная Каролина: Общество истории леса, c1994.
SD143 .F624 1999	Наука о лесах и дикой природе в Америке: история / Гарольд К. Стин, редактор.	[Дарем, Северная Каролина]: Общество истории леса, 1999.
SD356.52.U62 U587 1998	Исследование лесной службы: поиск ответов на вопросы сохранения / Гарольд К. Стин.	Дарем, Северная Каролина: Общество истории леса, 1998.
SD428.A2 O725 1940a	Лесное законодательство в истории лесных заповедников в Орегоне / Фрейда Ф. Гликман.	1940.; Фотокопия. [S.l. : s.n., 19—]. 28 см.
SD428.S26 R53 1999	Партнерство в сосновом лесу Пондероза: налаживание новых отношений для восстановления леса: тематическое исследование / Тим Ричард и Сэм Бернс.	Дуранго, Колорадо: Управление общественных служб, Колледж Форт-Льюис, 1999.
SD428.S29 P7 1999	Партнерство в Пайн Форест Пондероза: [управление сообществом на юго-западе Колорадо].	Дуранго, Колорадо Национальный лес Сан-Хуан, [1999]
SD428.W2 T83 1981	Исторические зарисовки национального леса Валлоуа / Джеральда Дж. Такера.	[Baker, Or. : Национальный лес Валлоуа-Уитмен, 1981]
SD436.I2 S6 1972	Пионеры-лесорубы: история стремления приобрести белые сосновые леса страны Клируотер в Айдахо / Ральф С. Спейс.	Льюистон, Айдахо: напечатано Printcraft Printing, c1972 г.
SD436.O7 S69 2000	Millicoma: биография тихоокеанского северо-западного леса / Артур В. Смит.	Дарем, Северная Каролина: Общество истории леса, 2000.
Sh448 .O72625 1992	Отчет группы по обзору прибрежного естественного кижуча в Орегоне: оценка состояния прибрежного природного кижуча в Орегоне в соответствии с определением перелова.	Портленд, штат Орегон. : Тихоокеанский совет по управлению рыболовством, [1992]
Sh451.h3 I51 no.49	Определение статистических областей IPHC / Томас М. Конг, Хизер Л. Гилрой и Ричард К. Лейкли.	Сиэтл, Вашингтон: Международная комиссия по тихоокеанскому палтусу, 2004.
Sh451.h3 I51 no.50	Изучение роли температуры и физических упражнений в развитии меловости тихоокеанского палтуса / Роберт Дж. Фой, Чарльз А.Крапо и Дональд Э. Крамер.	Сиэтл: Международная комиссия по тихоокеанскому палтусу, 2006 г.
Sh451.h3 I51 no.51	Пилотное исследование по оценке использования электронного мониторинга на промысловом траулере в Беринговом море / Ховард И. МакЭлдерри, Ронда Д. Рейди и Дейл Ф. Пахти.	Сиэтл, Вашингтон: Международная комиссия по тихоокеанскому палтусу, 2008.
U395.G7 h49 2000	Сохранение мира, история Олдермастона: краткий отчет о первых пятидесяти годах существования британской системы ядерного сдерживания, Организации по атомному оружию, Олдермастон / Дэвид Дж. Разное Навигация по записям ← Липосакция бедер и живота: Ультразвуковая липосакция живота: низкая цена Как правильно красить ресницы краской в домашних условиях: Краска для ресниц 🥝 как правильно покрасить ресницы → Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт Найти: Рубрики Абдоминопластика Абдоминопластика живота Блефаропластика Блефаропластика век Глютеопластика Глютеопластика ягодиц Липофилинг Липофилинг лица Маммопластика Маммопластика груди Подтяжка Подтяжка тела Разное Рекомендации врачей Хейлопластика Хейлопластика губ 2019 © Все права защищены. Карта сайта