Мосса биозавивка отзывы: Биозавивка волос Mossa в Самаре — 150 мастеров, проверенные отзывы, цены и рейтинг на Профи

Содержание

Химическая завивка Mossa, фото и отзывы о процедуре

Биологическая завивка Mossa в салоне красоты Bonita.pro – это инновационный подход к созданию роскошных кудрей на волосах любого типа и степени поврежденности.

В состав большинства растворов, используемых для завивки волос входит тиогликолевая кислота, которая отлично держит укладку. Однако на этом ее достоинства заканчиваются и начинаются недостатки: неприятный запах во время процедуры, сохраняющийся даже после смывания раствора, негативное влияние на сами волосы и вполне вероятные аллергичекие реакции – все это поджидает женщину во время проведения химической завивки. Каждая, кто хоть раз прошел через эту процедуру, хорошо знаком с такими «приятными» последствиями, как ломкость и выпадение волос, тусклость цвета и ненатуральность прически.

Однако теперь, дорогие женщины, Вы можете стать обладательницами завораживающе прекрасных кудрей, сохранив при этом здоровье и красоту нежно любимых волос.

Наш салон красоты представляет Биологическую завивку Mossa от известного итальянского бренда Green Light — состав, в котором отсутствуют тиогликолевая кислота и ее производные, столь негативно влияющие на волосы и кожу головы. Входящие в состав раствора экстракт бамбука, протеины и витамины помогают поддержать здоровье волос во время процедуры биозавивки и обеспечивают превосходный результат.

Несмотря на мягкий состав, не травмирующий волосы, завивка получается очень стойкой и держится от трех месяцев до полугода,сходит мягко и не оставляет ярковыраженной демаркационной линии при отрастании волос. Различные составы позволяют создать кудри на тонких и нормальных волосах, а также в случае необходимости исправить ошибки, допущенные при завивке с использованием химических средств.

Благодаря столь мягкому воздействию на волосы, биозавивку можно сочетать с процедурами окрашивания или мелирования волос. Она не влияет на яркость и насыщенность цвета, волосы остаются мягкими и изумительно приятными на ощупь.

Мастера салона прошли соответствующие обучение Green Light и имеют все необходимые сертификаты.

С биологической завивкой Mossa Ваша мечта о красивых локонах станет реальностью!

Биозавивка волос mossa

Главная » Красота волос » Биозавивка волос mossa

Биозавивка волос. Ваши отзывы.

Krestovskiy

Мусяша

Долго читала отзывы про мастеров, ездила на консультацию к мастеру и решила сделать себе кудряшки. Сразу сказала мастеру,что не хочу сильно укорачивать волосы, но она меня убедила сделать каскадную стрижку, срезала не очень много.Сделала биозавивку Iso, но через четыре дня уже почти вся расплелась. Мастер сказала,что такое может быть и накрутила меня снова и еще укоротила волосы, только кое- где — эффект тот же. Результат- волосы обстрижены кусками, кудрей нет и что с этим делать я теперь не знаю.

Причину Вашей неполучившейся завивки, Вы в интернете не узнаете.

Но подобные случаи- не редкость и этому есть объяснимые причины: иногда виноват мастер, а иногда причиной такой неудачи могут быть препараты, которые использует клиент для домашнего ухода за волосами до завивки.

Мусяша

Пользовалась только Iso, видимо надо было другой состав для завивки брать…. Хотя кудряшек до сих пор хочется.

Вера

Это делает волосы более плотными и эластичными. Во время любой завивки идет Химическая реакция и об этом стоит помнить, поскольку если Вы делаете Био-завивку на крашенные волосы, то это повторное воздействие химической реакции на волосы( первое воздействие это было окрашивание). Не стоит ожидать на окрашенных волосах того же эффекта, как на натуральных. Следующий момент и очень Важный — любую завивку делают на влажные и чистые волосы! После завивки волосы ополаскивают ТОЛЬКО подходящим кондиционером. Шампунь используется после завивки через 48 часов- это техническое данное, и в лабораториях сидят профессиональные химики, которые это рекомендуют. Если у Вас будут вопросы пожалуйста пишите мне на почту [email protected] и я с удовольствием отвечу на все Ваши вопросы!

Елена

Подскажите, плиз, хорошего мастера по био-завивке в Санкт-Петербурге.

Krestovskiy

Мусяша

Пользовалась только Iso, видимо надо было другой состав для завивки брать. … Хотя кудряшек до сих пор хочется.

Попробуйте в следующий раз, сначала сделать тестирование волос, и только после этого соглашайтесь на завивку. Так будет надёжнее, чем делать завивку на угад.

Alenaa

где качественно делают биозавивку в Абакане? ооочень хочу кудряшки, а нашла только 1 салон и обращаться туда не хочется, отзывы о нем не самые лучшие(

Krestovskiy

До конца августа, у нас в салоне Бесплатно можно сделать тестирование обесцвеченных, сильно осветлённых волос. По результатам тестирование, Вы сможете узнать, какую завивку Вам лучше сделать или придётся отказаться от неё. Увидите много разных приспособлений и инструментов для химических завивок и я расскажу Вам о том, какие для этого существуют препараты и чем они отличаются. Сможете получить несколько ответов на любые вопросы связанные с Вашими волосами. До конца августа осталось не так уж много время, поэтому не тяните время, а звоните и записывайтесь прямо сейчас. +79117224114 (Санкт-Петербург)

Krestovskiy

Август и сентябрь- самые жаркие месяца и поэтому если Вы собрались отдыхать на море, купаться, загорать…. Если у Вас натуральные вьющиеся волосы или Вы недавно сделали перманент или биозавивку и Ваш парикмахер не проконсультировал Вас о том, что за волосами в жарких странах нужен особый уход, особенно если волосы вьющиеся. Если хотите узнать, почему Ваши любимые шампуни, которыми Вы привыкли пользоваться, нельзя брать в жаркие страны и что тогда лучше взять с собой и на многие другие вопросы могу ответить на консультации у нас в салоне. +79117224114 (Санкт-Петербург)

Так-же у нас, можно сделать специальные процедуры для защиты вьющихся волос от солёной воды и жаркого солнца.

Ирина

к. волосы очень быстро растут. Делала на длинну волос ниже груди (достаточно длинные). Завивка держалась около года, думаю, если периодически делать коррекцию отросших корней, то дольше даже. Но у меня очень густые вьющиеся волосы (не сильно), волосина не тонкая и упругая, возможно это тоже повлияло положительно на результат. Сейчас состояние волос отличное! Как и до завивки! Хочу снова сделать биозавивку этой же фирмы, очень понравидось и очень удобно! А с маленьким ребенком это просто спасение! Без завивки — постоянные гкльки/хвостики, т.к. волос вьется хаотично, либо постоянные утюжки/плойки — либо завивка! Сейчас длина волос уже по пояс почти! Буду делать вновь, хотя первый раз очень долго решалась, боялась будет пудель!

Бобир

Дорогие девчонки и женщины госпожа химия биозавивка это индивидуальный.я дам бесплатно консультации Москва рядом с метро Люблино и Братиславская 89194106901

Бобир

Здравствуйте уважаемые дорогие женщины !последнее время на каждом шагу салон красоты мастера. ..но я вам вот что скажу.уход за волосами занимаюсь..лечение волос.Nirvel.Keune.Lebel.а уже потом все что можно сделать. вывод.ко-мне консультации бесплатно..Москва.рядом с метро Люблино и Братиславская.89194106901

Бобир

Ирина

Девушки, а в Москве может кто-нибудь мастера или салон проверенный посоветовать для биозавивки?

консультация Бесплатно.г.Москварядом с метро Люблино и Братиславская.89194106901

Krestovskiy

В очередной раз цены на завивочные препараты иностранных производителей увеличились! Кризис в стране… Что делать, если хочется сделать красивую завивку, но не хочется это делать дешёвыми препаратами и не тратить на завивку много денег? Если Вы в Санкт-Петербурге, прямо сейчас позвоните мне +7-911-722-41-14 , то возможно успеете стать моделью для нового вида завивки волос, которая в скором времени возможно станет очень популярной в салонах красоты.

Наталья

Гость

Делаю биозавивку постоянно в течении уже лет четырех. Результат зависит исключительно от профессионализма мастера. ну, иногда и от его настроения:) результатами очень давольна! даже кончики волос перестали так сильно сечься! при этом волосы у меня тонкие, не очень густые, достаточно проблемные сами по себе — а с биозавивкой смогла нормально отрастить и поддерживать нормальный венешний вид! волосы в отличном состоянии. кстати, биозавивка вообще не сходит — как только отрастают сильно корни, иду делать опять — с периодичностью раз в пол года примерно. главное — найти хорошего спеца.

Наталья

Девочки поделитесь хорошим мастером…очень хочу зделать биозавивку хотелось только у хорошого мастера

Вика

Девочки, хочу дать совет по салону в г. Балашиха. Посетила студию beauty set на проспекте ленина 76, осталась очень довольна. Окраска волос в желаемый цвет, очень теплая обстановка и отношение, есть женский клуб) а мастер маникюра Олеся, это что то. советую! да материалы для волос, первый раз слышу, но компания с историей-alcina, очень качественный продукт!

Виктория

День назад сделала биозавивку. Долго выбирала салон, много читала о ней…….и вот результат!!!! У меня были длинные волосы.Мне сказали, что надо подстричься, потому что локоны будут только внизу. Подстригли и сожгли! Теперь у меня на голове мочало! Ни каких локонов! Я в шоке! Завтра на работу…..

Юся

Девочки, кто знает что-нибудь о биозавивке bes???может кто делал*?не могу опредлиться делать эстель ниагара или bes((информации про bes нигде почти нет(

Krestovskiy

Юся

Кто знает что-нибудь о биозавивке bes???может кто делал*?не могу опредлиться делать эстель ниагара или bes((информации про bes нигде почти нет(

Это самые дешёвые завивочные препараты. Estel (Россия), Bes (Италия)
Много ума не надо, что-бы выбрать. Но: лучше мастера найдите хорошего и пусть он сам выберет лосьон для завивки.

Окси

арина

это одно и тоже

ВНЕШНЕ,БЫВАЮТ ПОХОЖЕ,НО СОСТАВЫ РАЗНЫЕ,,ЧТО ВЛИЯЕТ НА КАЧЕСТВО ВОЛОСА,КАРВИНГ КОПЕЕЧНЫЙ СОСТАВ,,

Окси

ЧТО СКАЖЕТСЯ,НА КАЧЕСТВЕ ВОЛОСА ПОЗЖЕ,. .ПРИГЛАШАЮ НА МАЛАЮ САДОВУЮ В СПБ,тут множество вариантов индивидуально..

Окси

Виктория

А В КАКОМ МЕСТЕ ДЕЛАЛИ? ГОРОДЕ??

Гость

«лучше» пишется без мягкого знака. я понимаю, что беседа не об этом, но некоторым читающим, вероятно, как и мне, жжёт глаза. за информацию спасибо.

Гость

Подскажите пожалуйста, где хорошо сделают завивку в Омске?

Наталья

Кто из Омска подскажите профессионализма мастера в Омск по биозавивки????? не хочу чтобы мне испортили волосы не профессиональные мастера, заранее спасибо

Олала

Подскажите хороших мастеров по биозавивке Краснодар! Очень хочу но не знаю куда пойти

Елена

Может кто-нибудь подсказать мастера или салон по биозавивке в Екатеринбурге?

Вера

Милые Дамы! Если у Вас есть вопросы относительно щадящей Биозавивки Мосса звоните и спрашивайте! Я профессиональный парикмахер и работаю с этой завивкой долгое время! Я с удовольствием поделюсь с Вами полезной информацией , чтобы развеять Ваши опасения и сомнения по поводу Биозавивки Мосса! Звоните +7 916 617 88 32, пишите верафомина[email protected]маил. ру. Москва. Вера Фомина парикмахер

Гость

Приветик всем) делаю эту завивку уже лет 10,очень довольна ,красивые локоны и всегда объем на голове. А касательно мастера то я соглашусь что очень важно правильность проведения процедуры и подбора растворов. Так что рекомендую Моssa))

Юля

Ирина

Здравствуйте!) Я из Челябинска. Посоветуйте мастера для биозавивки… Я карвинг делаю, но вот думаю на биозавивку перейти. А вы когда волосы расчесываете? До мытья? Я после обязательно расчесываю и потом укладываю только…

подскажите пожалуйста и мне челябинского мастера. моя почта [email protected] спасибо большое

Наталья

Гость

Лия

Если не против, то поделюсь ссылкой для всех Казахстанских модниц и модников, офигенный сайт на котором анкеты мастеров и салонов, а так правдивые отзывы, возможность сравнить стоимость услуг, расположение на карте города и многие другой удобные фишки! Вот кстати ссылка непосредственно на мастеров по биозавивке волос https://newme. kz/astana/masters-biozavivka-volos

Виктория

Девчата, буду благодарна, если поделитесь информацией по мастерам биозавивки в Челябинске. Вдруг кому удалось все-таки найти спеца. Моя почта [email protected]

Катрин

Всем доброго времени суток!))
Девочки, я парикмахер-стилист!
Честно, я уговариваю клиента не делать завивку, но уговорить ещё никого не смогла, все кто хочет кудри, нацелены на баран:)))
Зато я стригу, крашу, мелирование любое, фольга, шапочка. Навороченные Омбре, шатуш, тоже делаю!
Обращайтесь, буду рада сделать красоту на вашей голове!:)
89162733536
Екатерина

Светлана

Гость

Вера

Милые Дамы!
Если у Вас есть вопросы относительно щадящей Биозавивки Мосса звоните и спрашивайте! Я профессиональный парикмахер и работаю с этой завивкой долгое время! Я с удовольствием поделюсь с Вами полезной информацией , чтобы развеять Ваши опасения и сомнения по поводу Биозавивки Мосса! Звоните +7 916 617 88 32, пишите [email protected] Москва. Вера Фомина парикмахер

Сева

Эльмира

Уже 2 недели хожу после биозавивки как амазонская красавица!!! Сразу стали смотреть особо, особенно мужчины. Волосы блестят!!! И никуда ничего не торчит. Только жаль что локоны не такие крупные, как хотелось бы (лицо у меня широкое). В салоне сказали, что крупные долго не продержатся на длинных волосах((((Волос был оч мягким, стал чуть пожестче стал, но И у корней стал суше — теперь мою волосы не каждый, а через 1-2 дня))))Ищите, девочки, проверенного завивщика!!))))))))) И будьте прекрасны!!!!!

Скажите плиз какой состав использовали?

Мари

Если интересует мастер по Био-завивке с опытом в Махачкале то вот номер 8928 979 87 37 .

Катя

Звоните!
89162733536 Катя
Бобир

консультация Бесплатно.г.Москварядом с метро Люблино и Братиславская.89194106901

Елена

Добрый вечер! Кого интересует биозавивка Mossa — обращайтесь ! Я — женский мастер с 24 летним стажем . Завивку Mossa делаю 14 лет . Обожаю этот состав ! При качественной накрутке и правильной диагностике волос получаем отличный результат ! Если заинтересует звоните. Москва 9161121074 елена

Гость

Сделать инверсионную, спиральную, вертикальную, завивку Olivia Garden, Automatic CurlMatic и многие другие виды завивок можно в Санкт-Петербурге.
https://vk.com/club1272088
тел.: +79117224114

Юля

Можно ли зделать биозавивку, на выпрямленые кератином волосы месяц назат?

Гость

Сева

. Скажите плиз какой состав использовали?

ЧТО-ТО ВЫ С 2009 ГОДА В АМАЗОНКАХ БЕГАЕТЕ… НА ПЕРВОЙ СТРАНИЦЕ ВЫ ТО ЖЕ САМОЕ ПИСАЛИ,ТОЛЬКО 7 ЛЕТ НАЗАД БЫЛО))))))

Алевтина

Скажите, пожалуйста, а в Старом Осколе биозавивку делают? И где найти этого чудо-мастера, а то надоело каждый день термобигуди на волосики наматывать

woman.ru⁪>

кошмарные последсвия биозавивки

Вем доброго времени суток!

Хочу поведать свою трагическую историю БИОЛАМИНИРОВАНИЯ волос.

Отметила достоинства только за первые 3 месяца. А потом уже пошли недостатки.

Решилась сделать завивку, проситав здесь ооооочень много комментов и, практически не найдя отрицательных (хотя они были, но я человек здавомыслящий, понимала, что всё зависит от волос, а у всех они разнве) я её таки сделала, тем более, мне необходимо было подсушить волосы, т.к. они у меня ну очень жирные, поэтому думала особого вреда мне не принесёт. Проконсультировалась с мастером, она сказала, что держится всё это месяцев 4-6 максимум при редком мытье головы. Потом всё станет как прежде. Опять прямые волосы. Вариант меня полностью устраивал. Я мою часто, через день (до завивки каждый день и по 2 часа укладывала, поэтому меня это достало и я решилась).

Короче не буду тянуть! Первое время конечно я была в восторге, ни многочасовой укладки, ни ежедневного мыться, встала оделась накрасилась и ушла. О прическе не думала. Но пришлось начать пить витамины, волосы очень сильно начали выпадать. Потом в ход пошли маски, дорогостоящие шампуни. От выпадения помогло. НО сама структура волос стала мочалкой! Сейчас прошёл год.

Итог: кол-ва волос в 2 раза меньше, завивка полностью не распрямилась. В основном только сверху, а под низом (чуть ниже затылка, так и висят кучеряшки). Приходится ещё дольше укладывать, чем раньше. Приходится пользоваться укладочными средствами, потом фено, выпрямителем, плойкой. Ходя до, только подсушивала феном и на бигуди, без пены, лаков и т.п…. Волосы торчат в разные стороны. А сейчас осень, от укладки толку нет, выходишь, на улицу, опять всё пушится и торчком. Но, хочу заметить, объём конечно есть. Оно и понятно, мочалка же.

Дура я, испортила напрочь волосы, теперь приходится отращивать. Пусть лучше будут прямые сосульки, постоянные укладки, чем такие мучения.

Девочки, может кто подскажет, как придать гладкость волосам. Ламинирование делать уже побаиваюсь. Тем более, прочитала отзывы.

Фотки ДО и после (но сделана она не сразу после завивки, прошло месяца 3). Того, что сейчас нет, потому что заплетаю в основном (но выложу, чтобы имели представление). Глядя на кончики приблизительно понятно. Позже постараюсь выложить в распущенном виде.

irecommend.ru⁪>

Биозавивка волос. Ваши отзывы.

Krestovskiy

Мусяша

Причину Вашей неполучившейся завивки, Вы в интернете не узнаете. Но подобные случаи- не редкость и этому есть объяснимые причины: иногда виноват мастер, а иногда причиной такой неудачи могут быть препараты, которые использует клиент для домашнего ухода за волосами до завивки.

Мусяша

Пользовалась только Iso, видимо надо было другой состав для завивки брать…. Хотя кудряшек до сих пор хочется.

Вера

Здравствуйте, Дамы! Я как профессиональный парикмахер могу сказать про Био-завивку Мосса только хорошие отзывы. Возможен такой вариант как попросить мастера сначала накрутить пару коклюшек и посмотреть что из этого получится. Далее, любой химический состав всегда смывается со временем щампунями и через пару месяцев завиток уже не будет таким ярко выраженным. Покупайте безсульфатные шампуни, которые не вымывают из волос » все до скрипа, в том числе краски или кератин». Что касается ранее окрашенных волос на которые Вы планируете делать даже такую деликатную завивку как Мосса, то прежде стоит пару недель делать восстановительные маски для волос( нанести на всю длинну питательную маску для волос и подержать хотя бы минут 40 под пленкой, типа пищевой или под шапочкой если есть). Это делает волосы более плотными и эластичными. Во время любой завивки идет Химическая реакция и об этом стоит помнить, поскольку если Вы делаете Био-завивку на крашенные волосы, то это повторное воздействие химической реакции на волосы( первое воздействие это было окрашивание). Не стоит ожидать на окрашенных волосах того же эффекта, как на натуральных. Следующий момент и очень Важный — любую завивку делают на влажные и чистые волосы! После завивки волосы ополаскивают ТОЛЬКО подходящим кондиционером. Шампунь используется после завивки через 48 часов- это техническое данное, и в лабораториях сидят профессиональные химики, которые это рекомендуют. Если у Вас будут вопросы пожалуйста пишите мне на почту [email protected] и я с удовольствием отвечу на все Ваши вопросы!

Елена

Подскажите, плиз, хорошего мастера по био-завивке в Санкт-Петербурге.

Krestovskiy

Мусяша

Пользовалась только Iso, видимо надо было другой состав для завивки брать…. Хотя кудряшек до сих пор хочется.

Alenaa

Krestovskiy

Ирина

Делала БИОзавивку фирмы MOSSA Гринлайт 2 года назад, результатом очень довольна осталась! Помыла голову, слегла нанесла пену, можно и без нее и пошла! Завиток упругий, никакими диффузорами не пользовалась! Только мокрые руки вместо расчески и все! Через полгода сделала порикорневую коррекцию, т.к. волосы очень быстро растут. Делала на длинну волос ниже груди (достаточно длинные). Завивка держалась около года, думаю, если периодически делать коррекцию отросших корней, то дольше даже. Но у меня очень густые вьющиеся волосы (не сильно), волосина не тонкая и упругая, возможно это тоже повлияло положительно на результат. Сейчас состояние волос отличное! Как и до завивки! Хочу снова сделать биозавивку этой же фирмы, очень понравидось и очень удобно! А с маленьким ребенком это просто спасение! Без завивки — постоянные гкльки/хвостики, т.к. волос вьется хаотично, либо постоянные утюжки/плойки — либо завивка! Сейчас длина волос уже по пояс почти! Буду делать вновь, хотя первый раз очень долго решалась, боялась будет пудель!

Бобир

Дорогие девчонки и женщины госпожа химия биозавивка это индивидуальный. я дам бесплатно консультации Москва рядом с метро Люблино и Братиславская 89194106901

Бобир

Здравствуйте уважаемые дорогие женщины !последнее время на каждом шагу салон красоты мастера…но я вам вот что скажу.уход за волосами занимаюсь..лечение волос.Nirvel.Keune.Lebel.а уже потом все что можно сделать. вывод.ко-мне консультации бесплатно..Москва.рядом с метро Люблино и Братиславская.89194106901

Бобир

Ирина

Девушки, а в Москве может кто-нибудь мастера или салон проверенный посоветовать для биозавивки?

консультация Бесплатно.г.Москварядом с метро Люблино и Братиславская.89194106901

Krestovskiy

Наталья

Гость

Наталья

Девочки поделитесь хорошим мастером…очень хочу зделать биозавивку хотелось только у хорошого мастера

Вика

Виктория

Юся

Krestovskiy

Юся

Окси

арина

это одно и тоже

ВНЕШНЕ,БЫВАЮТ ПОХОЖЕ,НО СОСТАВЫ РАЗНЫЕ,,ЧТО ВЛИЯЕТ НА КАЧЕСТВО ВОЛОСА,КАРВИНГ КОПЕЕЧНЫЙ СОСТАВ,,

Окси

ЧТО СКАЖЕТСЯ,НА КАЧЕСТВЕ ВОЛОСА ПОЗЖЕ,..ПРИГЛАШАЮ НА МАЛАЮ САДОВУЮ В СПБ,тут множество вариантов индивидуально..

Окси

Виктория

А В КАКОМ МЕСТЕ ДЕЛАЛИ? ГОРОДЕ??

Гость

Подскажите пожалуйста, где хорошо сделают завивку в Омске?

Наталья

Олала

Подскажите хороших мастеров по биозавивке Краснодар! Очень хочу но не знаю куда пойти

Елена

Может кто-нибудь подсказать мастера или салон по биозавивке в Екатеринбурге?

Вера

Гость

Юля

Ирина

подскажите пожалуйста и мне челябинского мастера. моя почта [email protected] спасибо большое

Наталья

Гость

Лия

Виктория

Катрин

Светлана

Гость

Вера

Милые Дамы!
Если у Вас есть вопросы относительно щадящей Биозавивки Мосса звоните и спрашивайте! Я профессиональный парикмахер и работаю с этой завивкой долгое время! Я с удовольствием поделюсь с Вами полезной информацией , чтобы развеять Ваши опасения и сомнения по поводу Биозавивки Мосса! Звоните +7 916 617 88 32, пишите [email protected] Москва. Вера Фомина парикмахер

Сева

Эльмира

Скажите плиз какой состав использовали?

Мари

Если интересует мастер по Био-завивке с опытом в Махачкале то вот номер 8928 979 87 37 .

Катя

Звоните!
89162733536 Катя
Бобир

консультация Бесплатно.г.Москварядом с метро Люблино и Братиславская.89194106901

Елена

Гость

Юля

Можно ли зделать биозавивку, на выпрямленые кератином волосы месяц назат?

Гость

Сева

. Скажите плиз какой состав использовали?

ЧТО-ТО ВЫ С 2009 ГОДА В АМАЗОНКАХ БЕГАЕТЕ… НА ПЕРВОЙ СТРАНИЦЕ ВЫ ТО ЖЕ САМОЕ ПИСАЛИ,ТОЛЬКО 7 ЛЕТ НАЗАД БЫЛО))))))

Алевтина

woman.ru⁪>

Mossa — как вариант на лето просто волшебно!

Буду писать коротко и по-существу. У меня ребенок, вышла на работу. Времени на укладку после мытья каждый день по утрам нет. Денег на еженедельный поход в парикмахерскую тоже нет. Выход для себя увидела в биозавивке. Почитала отзывы и решила сделать наиболее распространенную — Mossa. Делала рядом с домом, парикмахерскую эту знаю, там уже стриглась. Удовольствие это не дешевое, но я решила сделать себе подарок, да и кудряшки очень хотелось иметь постоянные. Закручивала на 2 размера бигудей: средние и мелкие. Теперь бы я сделала ее на средние и крупные вперемежку. И запах кстати у нее не такой уж ужасный! Я бы даже сказала, что приятный.))) Пахнет чем-то химическим, но это естественно)))

Волосы ДО: толстые, тяжелые, окрашивание постоянное (1 раз в месяц) Exel.

волосы до волосы до

Волосы после: они стали какие-то мягенькие что ли, пушистые. Если буз укладки совсем, то у меня распушаются в одуванчик. Я была к тому готова — масло у меня хорошее для волос есть, плюс укладочные средства разные.

Вывод: плюсы:

-эффект классный, мне нравятся кудряшки

-волосы нужно реже мыть. До этого через день обязательно, теперь раз в неделю достаточно (если конечно без укладочных средств)

-утром встала — водой побрызгала, руками пожамкала (маслом обработала) — и вперед на работу!)))

-можно высушить феном с вытягиванием и у вас прямые волосы!)))) (если кудряшки надоели)

минусы:

-на разных волосах разный эффект (у меня концы плохо взялись из-за толщины волос, а из-за тяжести они стали раскручиваться быстро. ) Я была готова к этому.

-волосы стали выпадать. Но это спорный вопрос из-за чего: рантше я изх ежедневно чесала и они тоже выпадали но понемножку каждый день, а тут ты раз в неделю чешешься когда моешь голову и сразу клок.

-стоит дорого.

Так что сами для себя думайте делать или нет. Выкладываю фото на протяжении 4х-5ти месяцев.

irecommend.ru⁪>

Технология биозавивки волос MOSSA — Сеть салонов красоты Naturel Studio

Многие женщины желают иметь вьющиеся волосы. Увы, от природы это дано не каждому, а использование химических средств для завивки останавливает многих женщин, не желающих такого жесткого воздействия на волосы и кожу головы. Если здоровье волос – единственная проблема, считайте, что она уже решена. Сегодня на рынке существует новое поколение препаратов для завивки, которые оказывают намного более щадящее действие на волосы и подходят для любого типа волос.

Мягкое воздействие

Новая биозавивка волос MOSSA является уникальной, она не имеет аналогов. Эта завивка деликатно воздействует на волосы и защищает их. В состав завивки входит экстракт бамбука, который проникает глубоко во внутреннюю структуру волос, бережно защищая и активно питая их, благодаря высокому содержанию витаминов и протеинов.

Немаловажно и то, что в этом препарате отсутствует аммиак, тиогликолевая кислота и перекись водорода – эти компоненты наносят наибольший вред волосам и коже головы. Отсутствие этих компонентов способствует мягкому воздействию на волосы без разрушения их структуры.

Основной действующий компонент биозавивки MOSSA – цистеамина хлоргидрат (аналог биологического белка цистина, который соединяет внутренние волокна волос). Компоненты обычной химической завивки не имеют такого сходства с натуральным белком, а потому их воздействие на волосы оказывается более «агрессивным» по сравнению с компонентами биозавивки. Соответственно, при использовании данного препарата волосы избегают лишнего разрушения, а также получают дополнительную порцию белка, что способствует укреплению волос, улучшению их структуры и внешнего вида. Это значит, что биозавивка подойдет для любого вида волос: натуральных, мелированных, окрашенных, даже ранее поврежденных химической завивкой и т.д.

Естественный вид

Процедура завивки технически проста, но ее результатом станут стойкие и упругие завитки. Стойкость биозавивки сопоставима с результатом обычной химической завивки – от трех до девяти месяцев (результат напрямую зависит от состояния и структуры волос, а также от выбранного размера завитков – меньшие держатся дольше). Более того, после биозавивки MOSSA волосы остаются мягкими, естественными, а также наполняются блеском. Вам не придется переживать по поводу окрашивания волос – цвет не подвергается изменению при биозавивке MOSSA, а окрашивать волосы можно сразу же после данной процедуры. Немаловажно и то, что в результате проведения биозавивки отсутствует резкая демаркационная линия по мере отрастания волос, благодаря сохранению структуры и цвета волос завивка сходит естественно и мягко. Повторять процедуру биозавивки можно каждые пять-шесть месяцев.

Уникальная технология

К вышеперечисленным достоинствам этой уникальной технологии, разработанной итальянской фирмой Green Light, можно еще отнести и возможность индивидуального подхода к нуждам каждого клиента. Мастер может подобрать активный состав на основе состояния и типа ваших волос, чтобы обеспечить максимальное соответствие. Выбор коклюшек зависит как от желаемого результата, так и от длины, состояния и структуры волос. Немаловажно и то, что только при помощи биозавивки MOSSA можно исправить ошибки традиционной химической завивки, при этом, не повреждая волосы.

Мастера салона красоты NATUREL STUDIO обеспечат индивидуальный подход и с радостью проконсультируют вас по любым вопросам относительно биозавивки волос. Обращаясь к профессионалам нашего салона, Вы может быть уверены в качестве и надежности результата.

Биозавивка мосса в Смоленске — адреса, отзывы и телефоны

Биозавивка мосса в Смоленске — организации с адресами и телефонами, отзывами и пользовательским рейтингом. Сайты и график работы компаний, списком предоставляемых дополнительных услуг.

Параметры поиска

Биозавивка мосса в Смоленске: адреса компаний

153 организации для ухода за волосами

1. Салон Изюминка
2. Ново-Киевский пер., 4Б
3. +7 (903) 64… показать все
4. _{ежедневно, 10:00–20:00}
4.6/534 оценки
1. MonAmi
2. ул. Рыленкова, 59
3. +7 (920) 31… показать все
4. _{пн-пт 10:00–19:00; сб,вс 10:00–17:00}
4. 3/513 оценок
1. Версаль
2. ул. Генерала Паскевича, 10
3. +7 (4812) 3… показать все
4. _{ежедневно, 10:00–20:00}
4.7/547 оценок
1. Milavida
2. Киевское ш., 56
3. _{ежедневно, 10:00–20:00}
4.6/535 оценок
1. 5 Авеню
2. ул. Рыленкова, 59
3. +7 (4812) 5… показать все
4. _{ежедневно, 10:00–20:00}
4.6/529 оценок
1. Светлана
2. ул. Кашена, 13
3. +7 (904) 36… показать все
4. _{ежедневно, 08:00–20:00}
4.6/518 оценок
1. Лэлита
2. пер. Зои Космодемьянской, 2
3. +7 (4812) 6… показать все
4. _{ежедневно, 09:00–21:00}
4.8/59 оценок
1. Самая
2. ул. 70 лет Победы, 2
3. +7 (4812) 6… показать все
4. _{ежедневно, 10:00–20:00}
4.6/510 оценок
1. Цирюльня
2. ул. 12 лет Октября, 2А
3. +7 (951) 69… показать все
4. _{ежедневно, 10:00–19:00}
4.4/519 оценок
1. Парикмахерская 67
2. ул. Валентины Гризодубовой, 2
3. +7 (951) 69… показать все
4. _{ежедневно, 10:00–20:00}
3.8/58 оценок
1. Парикмахерская
2. ул. Рыленкова, 85
3. +7 (904) 36… показать все
4. _{ежедневно, 10:00–20:00}
4.5/511 оценок
1. Адана
2. ул. Багратиона, 16
3. +7 (951) 71… показать все
4. _{ежедневно, 10:00–20:00}
3.6/534 оценки

12316на карте

Биозавивка волос MOSSA и SINERGY

Сегодня особой популярностью пользуются игривые завитки и красивые локоны, получить которые можно посредством обычной химзавивки волос. Для достижения желаемого эффекта используется тиогликолевая кислота – один из самых распространенных составов в химической завивке волос. Однако, несмотря на это, данная кислота обладает целым рядом неприятных побочных явлений – разрушает волосы, обладает неприятным запахом, может вызывать покраснения и кожный зуд и многое другое.

Бережная биозавивка волос, которая не портит волосы

Сегодня под руководством опытных специалистов итальянской компании SINERGY была разработана специальная технология биологической завивки волос. Уникальная особенность её заключается в том, что её состав не содержит никаких химически агрессивных веществ, которые могут негативно повлиять на кожу головы и волосы. Биозавивка волос SINERGY очень бережно воздействует на волосы, не нарушая их структуру, а сходит самостоятельно и постепенно.

ВАЖНО! Биозавивка волос SINERGY и MOSSA не содержит:

тиогликолевой кислоты
аммиака
перекиси водорода

ВАЖНО! Биозавивка волос SINERGY и MOSSA содержит:

биологический белок цистеамин, аналог белка цистина, входящего в состав волоса
натуральные экстракты
а также высокое содержание протеинов и витаминов (витамин С, бета-каротин, витамин РР)

Завивки волос с таким составом дарят волосам жизненную силу, блеск и здоровье!
А это подтверждает, что SINERGY и Mossa безопасные для завивки волос!

Почему именно БИОсистема SINERGY и MOSSA:

можно на поврежденные волосы после химзавивки
натуральные, тонкие, ослабленные, обесцвеченные или окрашенные волосы
упругие, прочные завитки и восстановление структуры волос
в период беременности и лактации,
подростки

Однако, если химическая завивка вызвала серьезные повреждения волос, то лучше всего перед биозавивкой осуществить в салоне красоты «Шоко» курс восстановления волос при помощи лечебной косметики Green Light (Италия). Эффектом бережной завивки станут ухоженные, красивые и опрятные волосы.

Процедура биозавивки состоит из 4 этапов:

Очищение. Применяется шампунь с повышенным содержанием аминокислот для послушных и гладких волос, готовых к завивке.
Преобразование. Собственно уже на этой стадии волос насыщается белком и укрепляется в заранее заданной форме.
Закрепление. Для этой стадии используется неаллергенный бром, который отрезает путь цестеамину обратно во вне.
Ребаланс. Начинает действовать Sea Complex, который питает, кондиционирует и защищает волосы. Содержит протеины молока, сок алое вера, экстракты морской капусты, мяты, лайма и сок стеблей бамбука.

Технически несложная, безопасная для здоровья волос и кожи головы процедура биозавивки волос становится приятной и долгожданной, и в результате вы обретаете прекрасный стойкий завиток до 6 месяцев без изменения цвета.

Ждем Вас на деликатную биозавивку волос!

Профессионалы салона красоты «ШОКО» сделают Вам красивые завитки и локоны! Вам останется только выбрать форму и размер завитка! Уже сотни наших клиентов воплотили мечту кудрявых и здоровых волос! Они знают, где сделать биозавивку волос, а не химическую завивку, и оставили лучшие отзывы.

Биозавивки, био химия (mossa-13 лучших завивок)

13 ЛУЧШИХ ФИРМ ЗАВИВОК!

Био-завивка «Облако вуали» (япония)- Разбудите свои чувства возбуждающей
мягкостью шелковистых волос.

Пышные, волнистые, упругие, мягкие и шелковистые волосы. При использовании появляется соблазн трогать свои волосы снова и снова. «Облако вуали» Это новый эталон средств для завивки волос.
С его помощью волосы становятся упругими, послушными и хорошо удерживают влагу.
Помогает избежать пересушивания волос и потерю влаги.
Содержит био-компоненты: коллаген и рафинозу, которые позволяют нейтрализовать действие щелочи и иных активных веществ, помогают удерживать влагу в Ваших волосах. Благодаря этим компонентам во время завивки теряется вдвое меньше влаги, чем при использовании обычных средств.
Дарит чувство комфорта во время завивки. Содержит экстракт дрожжей и вытяжку из натуральных чайных листьев, которые УНИЧТОЖАЮТ, а не маскируют запахи, возникающие в процессе завивки и после нее.
Мягкое связующее вещество состоит из 4-х био-компонентов, которые эффективно восстанавливают внутреннюю структуру волос. Белок пшеницы, Н-Т шелк, лецитин и керамидный комплекс.
В итоге после применения «Облако вуали» Вы имеете соблазнительные, послушные и мягкие локоны идеальной завивки. Вместо жестких, грубых и пересушенных волос ощутите их шелковистость до самых кончиков…

BIO-ЗАВИВКА PAUL MITCHELL (США) НОВИНКА 2010!

Вы хотите получить естественный упругий локон на долгое время и не повредить Вашим волосам- есть решение…биозавивка. Уникальная технология биозавивки , не содержащая в активном составе химических ингредиентов, повреждающих структуру волоса и кожу головы. Не изменяет цвет волос и не ослабляет их блеск. Держится практически столько же, сколько Ваших волосах держалась бы стандартная химическая завивка. Так же отметим, что она не образует резкой линии при отрастании волос (во-первых, из-за сохранения цвета волос, во-вторых, из-за сохранения их структуры), и сходит мягко и естественно, не превращая волосы в солому. Те, кто хоть раз испробовал на себе обычную химическую завивку, по достоинству оценят все прелести биозавивки.
Завивка для стойких, натуральных волос и волос, подвергавшихся химической обработке.
Не содержит аммиака и тиогликолиевой кислоты. Экстракт бамбука, благодаря высокому содержанию протеинов и витаминов (содержит витамин С, бета-каротин, витамин РР),дарит волосам жизненную силу и здоровье!
Современная био-завивка располагает качественными высокоэффективными препаратами. От прежней химии остался только принцип завивания волос, основывающийся на видоизменении структуры волоса. Профессионалы утверждают, что современная завивка не причиняет вреда волосам, более того она нормализует их состояние. Биологическая завивка линии TEXTURE PAUL MITCHELL® уникальна тем, что ее можно делать на любых волосах. Активный компонент био-завивки – производная аминокислоты, составляющей кератин волоса (его составная часть). Это первая в мире завивка, которая реструктуирует волосы, не повреждая их. В результате завивки волосы не подвергаются разрушениям, а, наоборот, наполняется белком, укрепляются, улучшают свою структуру и внешний вид.
Завивке могут быть подвергнуты волосы в любом состоянии БИОЗАВИВКА– ее применение дает удивительные результаты: локоны становятся нежными и прочными; кондиционирующий эффект придает волосам свободный и естественный стиль. С новой формулой волосы остаются в прекрасном состоянии, они – мягкие, естественные, с неповрежденной структурой, исключительно привлекательные и пышные!PAUL MITCHELL!!!

Матричная чудо-завивка будущего!
Ушли в прошлое те времена, когда химическая завивка считалась вредной процедурой, наносящей волосам непоправимый вред. XXI век принес новые технологические особенности в процедуры. Химическая завивка выполняется с применением специальных питательных систем, масок для волос и витаминных комплексов.

Легкая завивка подойдет даже волосам с тонкой структурой, она сможет укрепить их и сделать визуально совершенными.

Мягкая завивка подарит послушную мягкость и необходимую естественную пышность даже самым непослушным волосам. При помощи завивки сверхчувствительные, ослабленные волосы можно сделать здоровыми, придать им блеск и очарование.

Японские учёные разработали качественно новый состав для завивки. Его громадный плюс заключается в том, что раствор стал pH-нейтральным. И теперь для формирования завитка используется не метод разрыва связей и восстановления их в другом направлении (что применяется в обычной химической завивке), а всего лишь их растягивание, что и придаёт желаемую форму волосу. Но S-связи не могут быть всё время растянуты. Со временем они стягиваются, и волосы приобретают первоначальный вид, не повреждаясь. Обычно это происходит через 3-5 месяцев.

Другое неоспоримое преимущество заключается в том, что «чудо-завивка будущего» — STEALTH насыщает волос необходимыми ингредиентами, восстанавливая тем самым соединения в S-связях, которые потом легко переформировать, и кудри сохраняются столь долго, как на здоровых, сильных волосах!

Хорошее средство для завивки волос создает волнистые и кудрявые волосы, с прогнозируемым результатом. Серия STEALTH разработана таким образом, что создает упругие локоны, которые вы можете использовать при создании любой прически, любого стиля. Созданный по особой рецептуре и с добавлением хорошо сбалансированных ингредиентов, STEALTH создает любые волнистые и кудрявые волосы по вашему желанию.

Матрикс волоса играет очень важную роль при решении вопросов, касающихся завивки и создания формы кудрей. Поврежденные волосы теряют межклеточное вещество, поэтому возникают трудности по созданию кудрей, и они быстрее теряют форму. STEALTH обеспечивает матрикс волоса необходимыми ингредиентами и создает условия, при которых будет легче создать кудри и дольше сохранить их форму.

ИНГРЕДИЕНТЫ МЕЖКЛЕТОЧНОГО ВЕЩЕСТВА (МАТРИКСА), ПОМОГАЮЩИЕ КУДРЯМ ДОЛЬШЕ ОСТАВАТЬСЯ УСТОЙЧИВЫМИ.

*КЕРАТИН
(восстанавливает структуру волос)
В поврежденных волосах не содержится аминокислота. Кератин заполняет пустоты и укрепляет солевые соединения по принципу поперечных связей. Он помогает волосам снова обрести силу, делает их упругими, блестящими и волнистыми.

*КРЕМНИЙ-ЦИСТИН
(восстанавливает структуру волос)
Кремний-цистин — это комплексное соединение таких элементов, как цистин (аминокислота, которая входит в структуру волоса) и кремний, который помогает волосам оставаться кудрявыми и волнистыми, потому что он проникает в структуру волос и укрепляет цистиновые соединения. Кремний-цистин восстанавливает и контролирует поврежденные волосы, благодаря тому, что он укрепляет структуру волос. Молекулы кремний-цистина распадаются на меньшие частицы и глубоко проникают в волосяную структуру. Оказавшись внутри, они воздействуют на полипептиды, сами себя рекомбинируют и остаются внутри волосяной структуры, чтобы укрепить цистиновые соединения и волосяной стержень, а в результате и сам волос.
Цистин улучшает текстуру волоса, они становятся более сильными. Придает волосам ощущение свежести и удерживает влагу. Создается эффект живых волос. Делает волосы мягкими, гладкими по текстуре и волнистыми.

*БЕТАИН
(восстанавливает структуру волос)
Когда волосы повреждены, они теряют влагу и становятся сухими и безжизненными, что в дальнейшем только усиливает повреждение и ухудшает структуру волос. Бетаин увлажняет волосы, потому что он поглощает влагу и остается внутри волосяной структуры. Также он укрепляет кислородные соединения. Благодаря ему волосы выглядят хорошо-увлажненными и волнистыми.

*ПРОТЕИН ПШЕНИЦЫ(защищает волосы)

*КОМПЛЕКС КЕРАМИДОВ(увлажняет волосы)

*H-T ШЕЛК(защищает волосы)

*ЛЕЦИТИН(увлажняет волосы)

«Чудо-завивка будущего» — STEALTH, одна из последних разработок японских ученых, которые, как известно ко всем решениям и изобретениям подходят неординарно — способна творить просто чудеса!

БИОЗАВИВКА КУДРИ АНГЕЛА
Био-завивка «Кудри Ангела» не содержит триогликолевой кислоты и ее производных, не содержит аммиака.
Биозавивка «Кудри ангела» является новым шагом в истории биозавивок. Еерекомендуют применять для осветленных, либо мелированных волос, которым обычная химическая завивка может нанести существенный вред. Примерно через 4-6 месяцев ваши локоны просто постепенно раскрутятся, а волосы останутся не поврежденными.
В состав биозавивки «Кудри ангела» входят ботанические экстракты, структурныеаминокислоты и восстановительный комплекс PBBS , основу которого создаютпротеины. Результатом воздействия этого комплекса станет здоровый, блестящий,«живой» и красивый вид волос. После процедуры завивки «Кудри ангела», входящие
в ее состав ботанические экстракты увлажняют и успокаивают волосы и кожу головы, придают волосам ухоженный вид и мягкость.
Биозавивка «Кудри ангела» создает мягкие локоны и волны!
Меняйте свой образ и своё настроение вместе с мастерами нашего салона красоты и с новой совершенно уникальной биозавивкой: Кудри Ангела.

БИОЗАВИВКА TWISTY :Новинка — БИО ЗАВИВКА волос TWISTY!

Биозавивка волос TWISTY — продукт нового поколения! Имеет эксклюзивную и биологически натуральную формулу, представляющую собой абсолютно новое открытие в области трансформации волос.
Основной действующий компонент состава TWISTY – аминокислота — цистеин, производная белка овечьей шерсти. Формула ее практически идентична цистеину человеческого волоса (кератин волоса состоит из аминокислот, наиболее важной из которых является цистеин).
Содержит натуральный лечебный и защитный комплекс на основе протеинов шелка и экстракта бамбука.
TWISTY – высокотехнологичный продукт, идеально сочетающий надежность с естественностью и бережным отношением к структуре волос.

БИОЗАВИВКА *ТРАНСФОРМЕР*
для долговременного изменения текстуры волос. Не разрушает связи,укрепляет волосы и фиксирует заданную форму за счет достраивания дополнительных связей.Расчитана на 2-3месяца.После чего волосы возвращаются в первоначальное состояние.

Биозавивка ISO Option
Чем же отличается биозавивка ISO Option от классической химической, содержащей тиогликоль? Всё просто! Волос имеет отрицательный заряд, причём, при повреждении сила этого заряда возрастает. Тиогликоль также заряжен отрицательно, поэтому волос отталкивает, отвергает его, и единственный возможный способ для препарата проникнуть в структуру — это агрессивно раскрывать кутикулу, повреждая волос.

А для того, чтобы ослабить вредные последствия, в состав таких средств для завивки, включают утяжелённые увлажняющие компоненты, которые могут помешать химическому процессу или ослабить его. Поэтому инновационная биозавивка ISO Option была разработана с учётом всех этих факторов.

В основе составов содержится эксклюзивный и запатентованный компонент ISOамин — аналог натурального цистеина волоса. Это положительно заряженный компонент, который легко притягивается к отрицательно заряженному волосу (как металл к магниту) и, вследствие этого, беспрепятственно и мягко проникает внутрь, не повреждая кутикулу.

Благодаря более глубокому и равномерному проникновению, ISOамин позволяет получать превосходные локоны желаемой формы, и, при этом, оставляет волосы здоровыми и сильными. По этой причине биозавивка ISO даёт превосходные результаты и на осветлённых, мелированных волосах.

Какими бы ни были Ваши волосы, биозавивка сделает по-настоящему сильными и здоровыми, а также обеспечит им нужную степень кудрявости. С нашими материалами Вы сможете получить прекрасный результат, показывающий Ваши волосы в наиболее выгодном свете и цвете — поскольку наша биозавивка с легкостью позволит подобрать подходящий состав для всех типов волос.

Седые или обесцвеченные, окрашенные или «уставшие» — к каждому виду волос требуется индивидуальный подход. Например, если волосы мелированы или окрашены прядями, для достижения нужного эффекта необходимо использовать не один, а поочередно разные составы. Только тогда Вы получите естественные упругие и блестящие локоны. Держится такая прическа намного дольше химической завивки, однако при этом не иссушается и не разрушается внутренняя структура каждого волоса. Синтез активных компонентов для биозавивки укрепляет и питает волосы.

Биозавивка MOSSA:
Итальянской фирмой была разработана и запатентована уникальная технология завивки MOSSA, не содержащая в активном составе никаких химических ингредиентов, повреждающих структуру волоса и кожу головы. Состав для MOSSA не съедает цвет волос и не ослабляет их блеск. При этом по длительности MOSSA держится практически столько же, сколько продержалась бы на Ваших волосах стандартная химическая завивка. Другим важным позитивом
БИОзавивки является то, что она не образует резкой демаркационной линии при отрастании волос (во-первых, из-за сохранения цвета волос, во-вторых, из-за сохранения их структуры), а сходит мягко и естественно, не превращая волосы в солому. Те, кто хоть раз испробовал на себе обычную химическую завивку, по достоинству оценят все прелести MOSSA.

БИОсостав предоставляет поистине неограниченные возможности для творческой фантазии мастера и длительного БИОстайлинга. С его помощью в руках умелого парикмахера Ваши волосы могут превратиться в соответствии с Вашими пожеланиями и в упругие локоны, и в задорные мелкие кудряшки, и в стильные волны. Все это определяется размером и формой коклюшек (бигудей для завивки), на которые накручиваются волосы в процессе БИОзавивки. Деликатная формула, защитное действие экстракта бамбука и отсутствие тиогликолевой кислоты, аммиака и
перекиси водорода гарантирует эффективный результат без повреждения структуры волоса. Био завивка очень хорошо подходит для тонких и поврежденных волос. Завиток при этом можно сделать любой.

Шелковая волна
Перманентная шелковая завивка CHI Ionic Permanent Shine Waves!!!Кудрявые, пышные и красивые волосы – мечта многих и многих женщин. И так было всегда – еще богатые и знатные древние гречанки завивали свою шевелюру, и это считалось верхом шика. Кто поймет загадочную женскую душу? Почему именно прически, основанные именно на волнистости волос, никогда не выходят из моды? С революционной системой щелковой завивки можно без проблем создавать натуральные и роскошные локоны.
Завивка CHI — деликатная формула и отсутствие тиогликолевой кислоты, аммиака и перекиси водорода гарантирует эффективный результат без повреждения структуры волоса. Завивка очень хорошо подходит для тонких и поврежденных волос. Завиток при этом можно сделать любой. В состав входят протеины натурального шелка, который, бережно и глубоко проникая внутрь волоса, отдает свои чудесные свойства, при этом, абсолютно не травмируя волосы. Не зря натуральный шелк – во все времена считался самой чудесной, таинственной и дорогой тканью.

Перманентные шелковые завивки CHI Ionic Permanent Shine Waves
В нем – все тайны загадочного востока, откуда он и появился. Ну а сегодня протеины шелка отдают свой секрет Вашим волосам.

Отсутствие АММИАКА и наличие Шелка в завивках CHI открывает для наших клиентов новые возможности, так как это абсолютно безопасная завивка. Шелковая волна – подходит ослабленным волосам. Даже многократно окрашенные, измученные стрессами волосы становятся мягкими, послушными и шелковистыми после выполнения химической завивки «шелковая волна»: ее состав возвращает к жизни самые безнадежные волосы. Вы можете менять свою прическу без опасений за качество своих волос. А мы помогаем Вам в этом, при этом вы наслаждаетесь приятным запахом полыни, а не резким и небезопасным запахом аммиака
Завивка совершенно безвредна для беременных женщин и кормящих матерей.

Вообще, какую бы завивку Вы не выбрали стоит знать об одном существенном принципе. Едином для любых способов завивки. На то каким будет внешний вид завитка, на его форму и размер влияет техника накрутки и выбранные коклюшки.
А вот каким останется по качеству волос: будет ли он живым и здоровым или же повредиться, вот на это влияет в полном объеме только состав для завивки волос.

БИОЗАВИВКА ВОЛОС КИЕВ, БИОЗАВИВКА МОССА, БИОЗАВИВКА ЦЕНА КИЕВ, БИОЗАВИВКА ВОЛОС MOSSA, БИОЗАВИВКА ФОТО, БИОЗАВИВКА ВОЛОС, БИОЗАВИВКА ЛОКОНЫ, БИОЗАВИВКА ВОЛОС ОТЗЫВЫ, Работаю с биозавивкой с момента появления ее на Украине! Консультация и запись по телефону: 067 907 12 11

Внимание! Все работы биозавивки Mossa на фото- мои и защищены авторским правом!

Биозавивка волос MOSSA Киев

Биозавивка волос фото Mossa

Биозавивка волос Mossa 2013 февраль

MOSSA био-завивка волос 2009

Обновленный препарат биозавивки Mossa 2011

Биозавивка волос MOSSA

MOSSA биозавивка волос 2009

MOSSA биозавивка фото 2009 май

Биозавивка волос MOSSA 2009

Биозавивка волос MOSSA Киев

Биозавивка волос MOSSA

Биозавивка MOSSA

Биозавивка волос фото MOSSA

Биозавивка MOSSA Киев фото

Биозавивка волос MOSSA

Биозавивка MOSSA

Биозавивка волос MOSSA

Линия реконструкции волос

Биозавивка MOSSA

Биозавивка MOSSA фото Киев

Биозавивка волос Mossa

Биозавивка MOSSA

Биозавивка Mossa

Биозавивка волос MOSSA

Биозавивка MOSSA

Биозавивка биозавивка волос MOSSA

Биозавивка MOSSA

Биозавивка волос MOSSA

Биозавивка MOSSA

Биозавивка волос MOSSA

Биозавивка MOSSA

Биозавивка волос Mossa Киев

Биозавивка волос Киев Mossa

Биозавивка Mossa

Биозавивка Киев MOSSA

Биозавивка волос MOSSA фото

Биозавивка Киев MOSSA фото

Биозавивка волос MOSSA Киев

MOSSA биозавивка волос 2009

MOSSA биозавивка 2009 май

MOSSA биозавивка волос 2009

Биозавивка волос MOSSA

Био- завивка MOSSA 2009 май

MOSSA биозавивка волос 2009

Биозавивка волос Mossa

Биозавивка волос Mossa фото

Биозавивка волос MOSSA 2009

Биозавивка фото Mossa

Биозавивка волос фото Mossa

Наращивание волос

Биозавивка волос Киев Mossa

Биозавивка MOSSA 2009 июнь

Биозавивка волос Mossa

Биозавивка Mossa Киев фото

Биозавивка волос MOSSA 2009 июнь

Биозавивка Mossa

Биозавивка волос Mossa

MOSSA биозавивка волос 2009 июнь

Биозавивка Mossa фото Киев

Биозавивка MOSSA 2009 июнь

Биозавивка волос Mossa

MOSSA биозавивка фото 2009 июнь

Биозавивка Mossa фото Киев

Биозавивка Mossa фото

Биозавивка волос фото Mossa

Биозавивка MOSSA фото 2010

Биозавивка MOSSA 2010

MOSSA биозавивка волос фото 2010

MOSSA биозавивка волос 2010

Биозавивка волос MOSSA 2010

MOSSA биозавивка волос 2010

Биозавивка волос Киев MOSSA 2010

Биозавивка волос MOSSA фото 2010

MOSSA биозавивка волос 2010

Биозавивка волос MOSSA 2010

Биозавивка Киев Mossa 2011 май

Mossa биозавивка 2011 июнь

Биозавивка фото Киев Mossa 2011 май

Биозавивка волос Mossa 2011 май

Биозавивка Mossa 2011 июнь

Mossa фото 2011 май

Mossa биозавивка волос фото 2011 июнь

Биозавивка волос Mossa 2011 июнь

Биозавивка волос Mossa 2011 май

Mossa биозавивка волос 2011 май

Биозавивка волос Mossa 2011 июнь

Mossa биозавивка фото 2011 июнь

Mossa фото биозавивка волос 2011 июнь

Биозавивка волос Mossa 2011 июнь

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка волос Mossa 2013 февраль

Биозавивка волос Mossa

Биозавивка волос Киев 2013

Биозавивка волос Мосса

Биозавивка волос Мосса Киев 2013

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос цена Мосса Киев 2013

Био-завивка волос Мосса

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка волос цена Киев

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка фото Киев

Биозавивка 2013 Мосса

Биозавивка волос Киев

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка фото Киев

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка фото Киев

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка фото Киев

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка фото Киев

Биозавивка апрель 2013 Киев

Основные силы полярности ооцитов эволюционно сохраняются, но не могут влиять на вклад первых двух бластомеров в развитие бластоцист у млекопитающих

Abstract

Полярность ооцитов и формирование эмбрионального паттерна — хорошо установленные особенности развития у низших видов. Существует ли подобная форма предварительного формирования паттерна у млекопитающих, в настоящее время ведутся горячие споры у мышей. В этом исследовании этот вопрос впервые был исследован на овце как на модели крупного млекопитающего.Микрохирургическая трисекция неоплодотворенных MII-ооцитов показала, что кортикальная цитоплазма вокруг веретена (S) содержала значительные количества общих материнских мРНК и белков по сравнению с соответствующими полушариями цитопластов, которые были расположены либо рядом (NS), либо далеко (FS) от веретена. RT-qPCR предоставила поразительные примеры материнской мРНК, локализованной в субструктурах S ( NPM2 , GMNN , h29 , PCAF , DNMT3 A, DNMT1 и STELLA () , NANOG , POU5F1 и TET1 ) и FS ( GCN ) ооцита MII.Иммуноблоттинг показал, что специфические материнские белки DNMT3A и NANOG были асимметрично обогащены MII-веретено-половиной ооцитов. Топологический анализ точки входа сперматозоидов (SEP) показал, что сперматозоиды преимущественно поступают через половину веретена MII ооцитов. При этом топологическое положение первой плоскости спайности относительно SEP было вполне стохастическим. Пространственное сравнение содержания липидов выявило симметричное распределение липидов между двухклеточными бластомерами. Отслеживание клонов с использованием флуоресцентного красителя Dil показало, что, хотя потомство ведущего бластомера двухклеточных эмбрионов способствовало увеличению количества клеток в развитых бластоцистах по сравнению с отстающими аналогами, вклад ведущих и отстающих бластомеров в эмбрионально-абебриональные части эмбриона. развитые бластоцисты были почти беспристрастными.И, наконец, разделенные сестринские бластомеры двухклеточных эмбрионов имели в целом одинаковую вероятность остановки на любой стадии до бластоцисты (2-клеточная, 4-клеточная, 8-клеточная и морула) или достижения стадии бластоцисты. Был сделан вывод, что локализация материнских мРНК и белков на веретене эволюционно консервативна у млекопитающих, неоплодотворенный овец ооцит может считаться полярным в отношении пространственной регионализации материнских транскриптов и белков. Даже несмотря на то, что основные силы этой окончательной полярности ооцитов могут не сохраняться во время эмбрионального дробления.

Образец цитирования: Hosseini S-M, Moulavi F, Tanhaie-Vash N, Asgari V, Ghanaei H-R, Abedi-Dorche M, et al. (2016) Основные силы полярности ооцитов эволюционно сохраняются, но не могут влиять на вклад первых двух бластомеров в развитие бластоцист у млекопитающих. PLoS ONE 11 (3): e0148382. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382

Редактор: Цин-Юань Сунь, Институт зоологии Китайской академии наук, КИТАЙ

Поступила: 9 сентября 2015 г .; Одобрена: 18 января 2016 г .; Опубликован: 31 марта 2016 г.

Авторские права: © 2016 Hosseini et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Нет данных для размещения на веб-сайте. Все данные были включены в рукопись.

Финансирование: Эта работа была поддержана IRAN253658, Институтом Рояна. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Полярность ооцитов и формирование эмбрионального паттерна — хорошо установленные особенности развития у низших видов [1]. Однако давний вопрос в развитии млекопитающих заключается в том, как впервые устанавливается эмбрионально-абэмбриональная ось бластоцисты. Ответ на этот вопрос критически важен для того, чтобы знать, являются ли деления дробления, которые регулируют формирование эмбриональных осей, предварительно сформированными [2, 3] или влияют на установление тотипотентности [4] в развитии млекопитающих.В настоящее время существуют три классические модели для объяснения механизма спецификации ранних клеточных клонов у млекопитающих: «предварительное формирование паттерна», «внутреннее-внешнее» и «клеточная полярность» [3]. В модели до формирования паттерна аналогично механизму, который существует у Drosophila , C . elegans и Xenopus , детерминанты формирования эмбриональной оси ожидаются либо во время созревания ооцитов, либо после оплодотворения [5]. Модель внутри-снаружи указывает на важность топологического положения клеток на стадии морулы в формировании паттерна бластоцисты [6].И модель клеточной полярности указывает на важность апикальных и дистальных мембранных доменов, которые появляются на стадии эмбриона от 8 до 16 клеток в спецификации судьбы потомков эмбриональных клеток [7].

Основные механизмы формирования эмбриональных осей у млекопитающих изучены не полностью. У мышей, как наиболее изученной системы, механизм фиксации первой линии в настоящее время является предметом горячих споров. Ряд исследований полагают, что судьба мышиных клеток предустановлена, а потомки эмбриональных клеток, возникающие в результате первого деления дробления, имеют различную судьбу [5, 8, 9, 10, 11].Напротив, другие исследования полагают, что порядок дробления не определяет распределение клеток в эмбрионально-абэмбриональных регионах [12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19]. Асимметричная локализация материнских транскриптов является существенным детерминантом полярности, управляющим цис-регуляцией зиготических генов у многоклеточных [20, 21, 22]. Хотя предполагается сохранение этого механизма развития у млекопитающих, недавние сообщения противоречат аргументам как в пользу [1, 4, 21, 23, 24, 25], так и против [16, 26] идеи полярности ооцитов у мышей.Примечательно, что ряд исследований продемонстрировал, что оплодотворяющая сперма имеет предпочтительную точку входа (SEP) в ооцит у мышей [10, 16]. Даже несмотря на то, что последующее исследование последней группы предоставило доказательства того, что пространственная асимметрия, проявляемая первым полярным телом и пеллюцидной оболочкой, направляет SEP [18]. Если транскрипционная асимметрия действительно существует в неоплодотворенных ооцитах млекопитающих, возможно, что механизм формирования эмбриональной оси у высших млекопитающих устанавливается до оплодотворения, когда ооцит становится поляризованным.

Почему важно изучение паттерна эмбриона? В течение многих лет было рекомендовано вводить сперму вдали от первого полярного тельца во время интрацитопальмической инъекции сперматозоидов (ИКСИ) [27]. Перенос ядра соматической клетки (SCNT) осуществляется путем удаления части ооплазмы, которая охватывает MII-хромосомы [28]. Монозиготное сплетение имеет большие потенциальные последствия для размножения элитных животных и животных, находящихся под угрозой исчезновения [29]. Недавно монозиготное сплетение с использованием малых молекул предоставило многообещающую возможность разделить эмбрион на две части: часть, которая разовьется до срока, и другая часть, которую можно культивировать in vitro для создания аутологичных эмбриональных стволовых клеток (ESC) для своего хозяина [30, 31].Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) все чаще используется для выявления возможных генетических заболеваний или хромосомных аномалий эмбрионов. При рутинной процедуре ПГД биопсия одного (или нескольких) бластомеров проводится у эмбриона на третий день [32]. Все эти методы были разработаны на основе давней концепции, согласно которой у млекопитающих ооцит является симметричным, а бальстомеры ранних эмбрионов равны по своей компетенции. Даже если дальнейшие исследования могут подтвердить существование цитоплазматической «полярности» ооцитов и «неравенства» ранних бластомеров, для этих манипулятивных / диагностических методов могут потребоваться серьезные уточнения / модификации [33].

Отслеживание клонов эмбрионов на стадии дробления плохо изучено у видов млекопитающих, а не у мышей, и только два исследования оценили формирование паттерна эмбриона у свиней [34, 35]. Однако выбор адекватной животной модели для проверки биологических гипотез по-прежнему остается открытой проблемой, и все больше данных свидетельствует о том, что мышь не может быть подходящей моделью для биологических исследований на людях. Учитывая современные знания об образовании эмбриональной оси у мышей и из-за того, что существует близкое сходство между эмбрионами человека и овцы с точки зрения метаболизма и ключевых стадий до и после имплантации [36, 37, 38], мы использовали овец в качестве животного. модель для оценки вероятности полярности ооцитов и формирования паттерна эмбриона у видов млекопитающих.

Материалы и методы

Если не указано иное, все химические вещества и среды были получены от Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури, США) и Gibco (Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США), соответственно. Все процедуры, предпринятые в этом исследовании, были рассмотрены и одобрены институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Института Рояна.

Подготовка яйцеклеток и производство эмбрионов овец

Процедуры, используемые для подготовки ооцитов и получения эмбрионов in vitro, были такими, как описано ранее [28].Вкратце, всего 2308 яичников взрослых овец местных пород (в основном афшари и найени в возрасте от 9 месяцев до 7 лет) были получены на двух местных бойнях (города Хомейнишахр и Кашан) в провинции Исфахан, антральные фолликулы (2 –6 мм в диаметре) яичников аспирировали для получения кумулюсно-ооцитных комплексов (КОК). Выбранные КОК с гомогенной цитоплазмой и более чем тремя слоями окружающих кумулюсных клеток промывали трижды в среде 199 для культивирования тканей, забуференной гепатитом (HTCM199) + 10% овечьей сыворотки (SS), с последующими тремя дополнительными промываниями в среде для созревания (TCM199, содержащей 2.5 мМ Na-пируват, 1 мМ L-глутамин, 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10% SS, 10 мкг / мл овечьего ФСГ, 10 мкг / мл овечьего ЛГ, 1 мкг / мл эстрадиола-17β, и 0,1 мМ цистеамина). Затем ооциты культивировали в течение 20–22 ч группами по 20–25 человек в каплях по 100 мкл среды для созревания, покрытых минеральным маслом при 38,5 ° C, 5% CO ₂ и увлажненном воздухе. Созревшие КОК затем использовали для развития эмбрионов, а предполагаемые зиготы культивировали группами по 6-8 человек в каплях 20 мкл модифицированного состава описанной синтетической жидкости яйцевода (mSOF) при 39 ° C, 6% CO ₂, 5% O ₂ и увлажненный воздух на 168 ч [39].

Пространственное распределение материнской мРНК в MII-ооцитах

Чтобы понять пространственное распределение транскриптов в неоплодотворенных MII-ооцитах, был использован метод трисекции ооцитов для создания кортикальных материалов, содержащих материал веретена MII (S) и половинки ооцитов, которые были либо близкими (NS), либо далекими от ( FS) шпиндель MII (рис. 1 и 2A, видео S1). Для этого MII-ооциты сначала обрабатывали проназой (0,05% в HTCM199) для удаления зоны. Ранее было показано, что после удаления зоны MII-ооциты овцы частично вытесняют веретено MII и связанные с ним хромосомы в виде четко видимого цитоплазматического выпячивания.Этот цитоплазматический выпячивание легко различить как референтное положение для правильного деления пополам MII-ооцита к половинкам NS и FS, как описано в другом месте [40]. Полученные половинки NS затем использовали для приготовления кортикальных материалов, содержащих MII-хромосомы (S) и энуклеированные половинки NS, с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (Olympus, IX71, Япония), оснащенного системой микроманипуляторов (Narishige, Япония). Плазматическая мембрана обычно инкапсулирует изолированную MII-хромосому в виде интактного цитоплазматического фрагмента.Чтобы подтвердить успешное рассечение и удаление веретена, ооциты окрашивали Hoechst 33342 (5 мкг / мл, 5 мин) перед микрохирургией. Затем разрезанные ооциты визуализировали кратковременным УФ-облучением. Для каждой повторности пулы цитоплазматических фрагментов S, NS и FS были приготовлены из 100–150 ооцитов.

Рис. 1. Схематическое изображение процедуры микрохирургической трисекции неоплодотворенных MII-ооцитов овцы с использованием ручного метода трисекции ооцитов.

A, B) Созревшие in vitro ооциты были очищены от кумулюсных клеток, и ооциты с очевидным первым полярным тельцем (1Pb) были отобраны для удаления зоны.C) Ооциты овцы частично выдавливают веретено MII и связанные с ним хромосомы (S) в виде цитоплазматического выступа, который особенно очевиден после удаления зоны. D) Используя этот цитоплазматический выступ в качестве контрольной точки, ооциты сначала делят пополам на полушария ооцита, которые находятся либо близко (NS), либо далеко от (FS) веретена MII (S). E) Полученные полушария NS-ооцитов затем использовали для приготовления кортикальных материалов, содержащих MII-хромосомы (S) и энуклеированные полушарии NS-ооцитов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.g001

Рис. 2. Исследование ассиметрии транскриптов в ооците и раннем эмбрионе.

A) Неоплодотворенные овцы MII-ооциты подвергали микрохирургической трисекции для получения кортикальных материалов, содержащих материал веретена MII (S) и полушария ооцита, которые находились либо близко (NS), либо далеко от (FS) веретена MII. Готовили пулы цитоплазматических фрагментов S, NS и FS и использовали для сравнительной RT-qPCR с использованием 21 гена, важного для развития.Полученные профили выявили четыре образца содержания транскриптов в трех фрагментах ооцита. B) Чтобы понять, наследуют ли ранние эмбрионы овцы дифференциальную локализацию транскриптов, наблюдаемую в MII-ооците, транскрипционное распределение транскриптов между ранними эмбриональными сестринскими бластомерами было исследовано с помощью RT-qPCR. Для этой цели один бластомер раннего эмбриона овцы был помечен Dil, и за эмбрионами наблюдали во время первого и второго эмбриональных делений для создания пулов ведущих и отстающих бластомеров.Ведущий и запаздывающий пулы бластомеров использовали для количественного анализа тех транскриптов, которые, как было обнаружено, дифференциально локализованы с неоплодотворенными ооцитами MII.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.g002

Пространственное распределение материнской мРНК между сестринскими бластомерами ранних эмбрионов

Чтобы понять распределение транскриптов между ранними эмбриональными сестринскими бластомерами (рис. 2В), 2-клеточные эмбрионы овцы были собраны примерно через 18 часов после ЭКО и использованы для случайной маркировки одного сестринского бластомера с использованием флуоресцентного красителя Dil (1,10-диоктадецил-3, 3,30,30-тетраметилиндокарбоцианина перхлорат), как описано Park et al.[35]. Вкратце, Dil растворяли в кукурузном масле в концентрации 2,5 мг / мл при 60 ° C, давали остыть и затем немедленно использовали. Микропипетка с очень острым скосом была заполнена красителем и присоединена к инвертированному микроскопу (Olympus, IX71, Япония), оборудованному системой микроманипуляторов Narishige. Мечение было выполнено путем внутрицитоплазматической инъекции капель Dil случайным образом в один двухклеточный бластомер. Меченые эмбрионы затем культивировали в среде mSOF для мониторинга расщепления и улавливания 3-х клеточных эмбрионов перед делением 3 клетки → 4 клетки.Три клеточных эмбриона обрабатывали проназой для удаления зоны и осторожно пипетировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) для отделения бластомеров. Используя инвертированный флуоресцентный микроскоп, отдельные бластомеры наблюдали при кратковременном УФ-облучении, чтобы собрать сестринские бластомеры второго расщепления (происходящие из ведущего бластомера) и отстающие бластомеры (происходящие из первого расщепления) в двух отдельных пулах (рис. 2). Образцы в минимальной посторонней среде были отдельно взяты в пипетку и барботированы в буфер RLT, который должен храниться в замороженном состоянии (-70 ° C) до экстракции РНК и количественной ПЦР в реальном времени (RT-qPCR).

Пространственное распределение сырых белков в неоплодотворенных овоцитах MII

Чтобы понять пространственное распределение белков в неоплодотворенных MII-ооцитах, с помощью ручного метода трисекции ооцитов были приготовлены пулы фрагментов S, NS и FS ооцитов (по 300 каждый) (рис. 1 и 2A, видео S1). Фрагменты ооцитов дважды промывали центрифугированием в PBS. Затем фрагменты удаляли из PBS и лизировали осторожным пипетированием в 150 мкл реагента TRI (Sigma) в соответствии с протоколом производителя.Концентрацию белка измеряли по методу Брэдфорда (Bio-Rad) в соответствии с рекомендациями производителя. Вкратце, фракцию солюбилизированного белка каждого образца (10 мкг) подвергали электрофорезу в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (SDS). Стадия фиксации геля (30% этанол, 10% уксусная кислота) выполнялась в течение 4 часов, а затем гель окрашивали коммерческим серебром. SDS-PAGE непрерывно проявляли в течение 10 минут для выявления белковых пятен. В качестве стандартов молекулярной массы одновременно запускали маркеры молекулярной массы белков (14–200 кД, Amersham).

Пространственное распределение специфических белков в неоплодотворенных ооцитах MII овцы

Чтобы понять поляризованное распределение особых материнских белков в неоплодотворенных MII-ооцитах, всего 3752 овечьих MII-ооцитов из 15 повторов были использованы для ручного деления пополам, чтобы подготовить достаточное количество фрагментов NS и FS ооцитов для иммуноблоттинга (рис. 1 и 2A, видео S1). Чтобы убедиться в специфичности антител, иммуноблоттинг был проведен на тканях (семенники и печень) и фибробластах овцы.Процедура иммуноблоттинга была описана ранее [31]. Вкратце, экстракцию белка проводили с помощью реагента TRI (Sigma-Aldrich). SDS-PAGE выполняли при 120 В в течение 2 ч с использованием клеток Mini-PROTEAN Tetra (Bio-Rad). Разделенные белки переносили на поливинилидендифторидную мембрану (PVDF; Bio-Rad) мокрым блоттингом (Bio-Rad). Мембраны блокировали в течение 1 ч 10% обезжиренным молоком и инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре с соответствующими первичными антителами: анти-NANOG (Sigma # N3038, 1: 200), анти-DNM3A (IMG # 268A, 1: 1000) и антиглицеральдегидфосфатдегидрогеназа (анти-GAPDH) (Sigma-Aldrich # A2228, 1: 5000).В конце инкубационного периода мембраны промывали смесью трис-буферного солевого раствора с твин 20 (TBST, 0,1% об. / Об.) Три раза по 15 мин каждый с последующей инкубацией с конъюгированными с HRP вторичными антителами (козьи антибиотики). -мышь (Dako # P0447, 1: 5000)). Связывание конъюгированного с HRP IgG с полосами белка визуализировали с помощью набора для обнаружения вестерн-блоттинга Amersham ECL Advance (GE Healthcare).

Топологическая оценка SEP в овечьих яйцах

Чтобы выяснить, является ли SEP случайным или специфическим в яйцах овец, мы исследовали топологическое расположение SEP в оплодотворенных ооцитах.В пилотных экспериментах по определению оптимального временного окна для достижения максимального раннего оплодотворения яйца овец через разные интервалы (ч) после оплодотворения (hpf: 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 12) были очищены от окружающих кумулюсных клеток. а затем обработали 0,25% проназой для удаления зоны. Затем зиготы фиксировали, окрашивали Hoechst-33342 и оценивали наличие конденсированной головки сперматозоида на периферии ооцита, как описано Schurmann et al. [41]. В другом наборе пилотных экспериментов для определения взаимосвязи между веретеном MII и первым полярным тельцем (pb) неоплодотворенные ооциты фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) в PBS и окрашивали Hoechst-33342.Затем была оценена топологическая взаимосвязь между веретеном MII и pb с использованием флуоресцентного микроскопа для микроманипуляций, как описано Rienzi et al. [42]. Первая серия пилотных экспериментов установила, что интервал 4-6 часов оплодотворения является оптимальным для достижения максимального раннего оплодотворения конденсированной периферической спермой (таблица S1). Полученные результаты второй серии пилотных экспериментов (таблица S2) показали, что в соответствии с исследованиями Hardarson et al. [43] и Rienzi et al.[42] у человека pb является слабым индикатором веретена MII, потому что он сильно смещается и отклоняется в пространственном положении относительно веретена MII, особенно после механической денудации путем вихря.

Процедура оценки SEP была в соответствии с Motosugi et al. [18] с некоторыми изменениями. Вкратце, кучевую корону диспергировали через 4–6 часов после оплодотворения (что составляет 26–28 часов после внутривенного вливания) осторожным пипетированием в 300 МЕ / мл гиалорунидазы в HTCM199, окрашивали Hoechst-33342 и переносили на предметный столик микроскопа микроманипулятора.Небольшую каплю Dil вводили в zona pelucida, непосредственно покрывающую мейотическое веретено, с использованием микроманипулятора с флуоресцентным оборудованием (Olympus, BX51, Япония). Только зиготы, имеющие конденсированный сперматозоид, использовали для Dil-мечения положения мейотического веретена, а неоплодотворенные ооциты или полиспермические зиготы исключались. Меченые зиготы инкубировали в 0,5% дигидрате цитрата натрия в течение нескольких минут до тех пор, пока часть цитоплазмы не выступала через крошечное отверстие в ZP, которое было введено проникающей спермой.Предполагаемые зиготы с четким выступом фиксировали в 4% PFA в PBS, окрашивали Hoechst-33342 и оценивали на предмет SEP с использованием микроманипулятора с флуоресцентным оборудованием (Olympus, BX51, Япония). Чтобы картировать SEP, зиготу вращали под постоянным УФ-светом и с помощью микроманипулятора выровняли две точки интереса, мейотическое веретено (помеченное инъекцией Dil в вышележащий ZP) и место проникновения сперматозоидов (на основе участка цитоплазматического выступа). от ZP) в фокальной плоскости, пересекающей экваториальную плоскость.Чтобы определить пространственные отношения между SEP и мейотическим веретеном, манипулируемые зиготы были подразделены на четыре воображаемые зоны (зоны I-IV), представляющие диски 3 × 30 ° и диск 1 × 180 °. На этой схеме зона-I была наиболее близкой к мейотическому веретену, тогда как зона-IV была наиболее удаленной от мейотического веретена.

Топологическая взаимосвязь между SEP и первой плоскостью дробления у ранних эмбрионов овцы

Чтобы понять возможную топологическую взаимосвязь между SEP и первой плоскостью расщепления, презумптивные зиготы через 4–6 часов после оплодотворения были удалены от кумулюсных клеток, окрашены Hoechst-33342 и перенесены на предметный столик микроскопа микроманипулятора.Чтобы составить карту SEP, яйца вращали с помощью микроманипулятора и под постоянным УФ-светом до тех пор, пока точка интереса, конденсированная проникающая сперма, не была отрегулирована на 3 часа. Одна капля масла была закачана в зону, непосредственно перекрывающую SEP. Меченые зиготы возвращали обратно в состояние культивирования эмбрионов для мониторинга дробления и первых двух эмбрионов примерно через 8–12 часов после маркировки зоны. Для документирования и анализа 2-клеточные эмбрионы были зафиксированы, а затем повернуты под постоянным УФ-светом и с помощью микроманипулятора для совмещения двух представляющих интерес точек, SEP (помеченного инъекцией Dil в вышележащий ZP) и плоскости деления в фокальной зоне. самолет, пересекающий экваториальную плоскость.Пространственное соотношение между SEP и плоскостью спайности измеряли, как описано выше.

Пространственное распределение липидных капель между сестринскими бластомерами ранних эмбрионов овцы

Содержание липидов в 2-клеточных эмбрионах было связано со смещенным образованием эмбриональной оси у свиней [34]. Чтобы исследовать эту возможность у овец, 2-клеточные эмбрионы были использованы для анализа общего содержания липидов с использованием нильского красного, флуоресцентного красителя, специфичного для внутриклеточных липидных капель [34, 44].После тщательной промывки в PBS образцы инкубировали с 0,2 мкг / мл нильского красного в течение ночи при 4 ° C. Затем образцы контрастировали с помощью Hoechst-33342, промывали в PBS и помещали на предметные стекла микроскопа в одной капле антибликового средства. После осторожного сжатия покровным стеклом образцы визуализировали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа (Olympus, BX51, Япония). После экспонирования цифровое изображение каждого образца было снято с помощью высокочувствительной камеры (Olympus DP-72), работающей на программном обеспечении DP2-BSW. Использование изображения J.программное обеспечение (Национальный институт психического здоровья, Бетесда, Мэриленд, США), была проанализирована средняя интенсивность флуоресценции между бластомерами эмбрионов на двухклеточной стадии.

Флуоресцентная маркировка бластомеров

Один бластомер овечьих эмбрионов на двухклеточной стадии был случайным образом помечен флуоресцентным Dil. После приготовления инъекционной иглы, как описано выше, произвольное мечение одного двухклеточного бластомера осуществляли путем интрацитоплазматической инъекции капли Dil, как описано Park et al.[35]. Меченые эмбрионы впоследствии культивировали в соответствующих средах для культивирования эмбрионов и проверяли на второе расщепление каждые 3-4 часа под стереомикроскопом. Затем эмбрионы на трехклеточной стадии исследовали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа на последовательность дробления. Эмбрионы были разделены на следующие две группы: 1) ведущие эмбрионы, у которых меченый бластомер расщеплялся первым, 2) отстающие эмбрионы, у которых немеченый бластомер расщеплялся первым. Арестованные эмбрионы (ни один из двухклеточных бластомеров не расщепился во время наблюдения) или эмбрионы с лизированным инъецированным бластомером были исключены из экспериментов, а интактные ведущие и отстающие эмбрионы культивировали еще 120 ч в mSOF.Чтобы понять, может ли отслеживание клонов Dil задерживать развитие эмбриона, регистрировали частоту и порядок расщепления в меченых и немеченых бластомерах двухклеточных эмбрионов.

Наблюдение за эмбрионами

В бластоцистах мышей нет согласия относительно углового градуса между осью Em-Ab и первой плоскостью дробления двухклеточного эмбриона, что является спорным [8, 12, 45]. Следовательно, первая плоскость расщепления определяется наиболее подходящей границей между когерентными флуоресцентными и нефлуоресцентными клетками.На основании угла между первой плоскостью дробления и осью Em-Ab (≤30 ° или> 30 °) меченые эмбрионы были классифицированы как ортогональные или девиантные [12]. Мы использовали модифицированный метод оценки бластоцист путем наиболее подходящего подхода к бластоцистам овцы (рис. 3).

Рис. 3. Отслеживание происхождения ведущих и отстающих бластомеров.

Когортная группа бластоцист, полученных из двухклеточных эмбрионов с лидирующей меткой, которые наблюдаются с использованием соответствующих фильтров Hoechst-33342 (A) и родамина (B).В) Критерии сортировки эмбрионов, меченных Dil. Оценка ориентации оси Em-Ab в бластоцистах овцы относительно первой плоскости дробления 2-клеточного эмбриона. После рисования воображаемых линий оси Em-Ab и экваториальной плоскости бластоцисты были разделены на три группы в зависимости от углового отклонения линии границы флуоресцентных / нефлуоресцентных клеток от экваториальной плоскости: i) указано: когда угловое отклонение было почти 90 °, ii) частично заданный: когда угловой вылет был ≥45 °, iii) неуказанный: когда угловой вылет был <45 °.D1-F4) Репрезентативные изображения определенных (D1-D4), полузаданных (E1-E4) и нестандартных (F1-F4), наблюдаемых при ярком свете (D1, E1 и F1), и h43342 (D2, E2) , & F2) и родамина (D3, E3, & F3). На изображениях D4, E4 и F4 показаны объединенные изображения h43342 и родамина. Полоса соответствует 100 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.g003

Вкратце, эмбрионы на стадии бластоцисты были зафиксированы, окрашены Hoechst-33342 и использованы для визуализации с помощью инвертированного микроскопа (Olympus, IX71, Япония) оснащен соответствующими фильтрами Rhodamine и Hoechst-33342.При ярком свете каждую бластоцисту первоначально удерживали с помощью пипетки, чтобы установить ICM на 3 или 9 часов. В этой схеме экваториальная плоскость, отделяющая весь ICM и полярный TE от остальной части TE, проходит параллельно плоскости обзора, а ось Em-Ab бластоцисты проходит перпендикулярно экваториальной плоскости [12]. С помощью стеклянной иглы, прикрепленной к системе микроманипулятора Narishige, бластоциста затем осторожно вращалась вдоль эмбрионально-абэмбриональной оси, чтобы определить количество клеток, происходящих из ведущих и отстающих, занимающих Em и Ab части.Полученную серию изображений использовали для построения целостного представления о локализации окрашенных и неокрашенных клеток с бластоцистой. Используя эти изображения, бластоцисты были классифицированы на три группы в зависимости от углового отклонения линии границы флуоресцентных / нефлуоресцентных клеток от экваториальной плоскости: i) заданные: когда угловое отклонение составляло почти 90 °, ii) полудетифицированные: когда угловое отклонение все еще было <45 °, iii) не указано: когда угловое отклонение было ≥45 °.

Компетенция развития соответствующих сестринских бластомеров

Чтобы понять компетентность сестринских бластомеров в развитии эмбрионов овец, эмбрионы на двухклеточной стадии использовали для разделения и культивирования сестринских бластомеров in vitro, как описано Held et al. (2012) [46]. Вкратце, zona-pelucida из 2-клеточных эмбрионов удалялась кратковременной обработкой 0,25% проназой, приготовленной в SOF, забуференном гепатитом (HSOF), в течение 1-2 мин. Сестринские бластомеры разделяли осторожным пипетированием в Hepes-SOF.Разделенные бластомеры, свободные от зон, культивировали индивидуально в микролунках. Вкратце, на дне неклейкой чашки Grainer 35 мм под минеральным маслом готовили каплю 20 мкл mSOF. С помощью стерилизованного самодельного бурильного молотка 12–16 небольших лунок просверливали в два параллельных ряда на пластиковом дне каждой культуральной капли. После уравновешивания соответствующие сестринские бластомеры, полученные из эмбрионов на двухклеточной стадии, помещали индивидуально в параллельные микролунки. Эти бластомеры культивировали еще 8 дней при 39 ° C, 5% O ₂, 6% CO ₂ и максимальной влажности.Последующее расщепление и развитие сестринских бластомеров до стадии бластоцисты оценивали на 3-й и 8-й дни соответственно. Компетенция развития соответствующих сестринских бластомеров была классифицирована как: 1) одно дальнейшее расщепление (2-клеточный блок: 2CB), 2) два следующих расщепления (4-клеточный блок: 4CB), 3) еще три расщепления (8-клеточный блок). : 8CB), 4) четыре дальнейших расщепления (блок морулы: MB) и те бластомеры, которые достигли стадии бластоцисты (BLS). Тех сестринских бластомеров, которые были остановлены без дальнейшего расщепления после разделения, было немного, и они не были включены в этот эксперимент.

Количественная ПЦР в реальном времени (RT-qPCR)

Обилие транскриптов 21 гена (таблица 1) сравнивали между пулами трехсекционных фрагментов ооцитов MII; S, NS и FS. Для выбора генов мы искали базы данных экспрессии РНК, чтобы найти гены, которые имеют одно обозначение в онтологии гена, связанное с плюрипотентностью и дифференцировкой ( SOX2 , NANOG , POU5F1 , FGFR2 , GATA4 , ) CDX2 Ремоделирование ядра ( NPM2 и GMNN ), импринтинг ( h29 и IGF2R ) и эпигенетическая модификация ДНК или гистона ( PCAF , DNMT3 A, DNMT3 TET1 , TET2 , TET3 , KAT5 , MLL1 , PCAF и STELLA ).Процедура RT-qPCR была описана ранее [47]. Вкратце, суммарную РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy Micro (Qiagen, Mississauga, ON, Canada) с последующей обработкой ДНКазой-I (Ambion, Streetsville, ON, Canada) в соответствии с протоколом производителя. Качество и количество РНК определяли на спектрофотометре WPA Biowave (Кембридж, Великобритания). Для обратной транскрипции 10 мкл общей РНК использовали в конечном объеме 20 мл реакции, содержащей 1 мкл Random Hexamer, 4 мкл буфера RT (10X), 2 мкл dNTP, 1 мкл ингибитора РНКазы (20 IU) и 1 мкл обратной транскриптазы (Fermentas, Glen Burnie, Онтарио, Канада).Обратную транскрипцию проводили при 25 ° C в течение 10 мин, 42 ° C в течение 1 часа и 70 ° C в течение 10 минут. Мастер-микс был приготовлен с использованием 1 мкл кДНК (50 нг), 5 мкл SYBR Green / 0,2 мкл основной смеси ROX qPCR (2X) (Fermentas, Германия) и 1 мкл прямого и обратного праймеров (5 пМ), доведенных до общий объем 10 мкл с использованием воды без нуклеаз. Для каждого праймера проводили три технических повтора RT-qPCR. Образцы CT каждого гена-мишени были нормализованы до CT GAPDH (из-за его стабильной экспрессии между группами) и представлены как 2 ^-ΔΔCT [48].Последовательности праймеров, температуры отжига и размер амплифицированных продуктов показаны в таблице 1.

Анализ целостности РНК

Для оценки целостности общей РНК аликвоты образцов РНК обрабатывали на денатурирующем агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. На этой схеме, прогон интактной тотальной РНК на денатурирующем геле имел четкие и четкие полосы 28S и 18S рРНК.

Статистический анализ

Все эксперименты повторяли не менее трех раз. Перед любым статистическим анализом оценивалась нормальность данных.Данные в процентах были преобразованы с помощью ArcSin и проанализированы с помощью модели одностороннего дисперсионного анализа SPSS версии 17 (SPSS, Science, Чикаго, Иллинойс, США). Различия сравнивали с помощью апостериорного критерия множественного сравнения Тьюки. Все данные выражены как среднее ± S.E.M. и различия считались достоверными при P <0,05.

Результаты

Оплодотворяющая сперма поступает преимущественно через половину мейотического веретена в ооциты овцы

Топологическая взаимосвязь между мейотическим веретеном и SEP суммирована на Рис. 4.Всего 211 моноспермических зигот использовали для оценки SEP в трех повторностях. Процент зигот, показывающих SEP в мейотической и немейотической половинах, составлял 74,9% (n = 158) и 25,1% (n = 53), соответственно. Важно отметить, что распределение SEP в мейотической половине не было случайным, поскольку какой-либо (0%) SEP наблюдался в зоне-I (~ 16,8% от общей площади ооцитов, которая является ближайшей к мейотическому веретену). Доля SEP в зоне-II (вторая ~ 16,8% от общей площади ооцитов, ближайшая к мейотическому веретену) была значительно выше, чем в зоне-III (69.6 против 40,4% соответственно).

Рис. 4. Топологическая оценка точки входа сперматозоидов (SEP) в яйцах овец.

Оплодотворенные ооциты вращали под постоянным УФ-светом до тех пор, пока веретено MII не было установлено на 3 часа. Затем было измерено пространственное соотношение между SEP и MII-веретеном в 4 воображаемых зонах ооцитов. На этой схеме зоны I и IV являются наиболее близкими и наиболее удаленными от шпинделя MII соответственно. В таблице представлены результаты топологической оценки SEP.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0148382.g004

Некоторые материнские мРНК асимметрично распределены в MII-ооците у овцы

Пространственный градиент материнской мРНК сравнивали между объединенными фрагментами ооцитов S, NS, FS, которые были получены с помощью микрохирургической трисекции 450 неоплодотворенных овоцитов MII в трех повторностях. Как показано на фиг.5, общее содержание мРНК объединенных субструктур FS (11,6 ± 2,1 нг / мкл) было сопоставимо с кумулятивным содержанием мРНК NS (6,5 ± 1,1 нг / мкл) + S (5.6 ± 0,9 нг / мкл) -структуры. Общее содержание мРНК фрагмента S ооцита было значительно ниже, чем у аналогов FS, но NS. Несмотря на то, что выделенный фрагмент S-ооцита составляет только ~ 2,9% от общего объема ооцита, пропорциональное содержание мРНК в S-субструктурах было оценено в 8 и 14 раз выше, чем фрагменты NS и FS ооцитов, соответственно.

Количественное сравнение транскриптов между фрагментами ооцитов S, NS и FS (рис. 6) показало, что из 21 проанализированного транскрипта 12 (57%) и 9 (43%) показали асимметричное и симметричное распределение внутри MII-ооцита, соответственно (рис. 2А и 6).Основываясь на паттернах регионализации в MII-ооците, эти транскрипты можно отнести к тем транскриптам, которые i) более многочисленны в S по сравнению с аналогами NS или FS ( NPM2 , GMNN , h29 , PCAF , DNMT3a , DNMT1 и STELLA ), ii) больше в NS по сравнению с аналогами S или FS ( SOX2 , NANOG , POU5F1 и TET1 ) больше в FS по сравнению с NS или S аналогами ( GCN ), и iv) равномерно распределены по ооциту ( FGFR2 , NML1 , CDX2 , TIP60 , DNMT3B , IGF2 GATA4 , TET2 и TET3 ).

Для оценки целостности общей РНК аликвоту каждого образца РНК обрабатывали на денатурирующем агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. Интактная общая РНК, нанесенная на денатурирующий гель, будет иметь четкие, четкие полосы 28S и 18S рРНК, что указывает на качество РНК (S1 фиг.).

Сестринские бластомеры 3-клеточных эмбрионов не наследуют асимметричные транскрипты MII-ооцитов овцы

Поскольку 12 транскриптов показали асимметричную регионализацию внутри MII-ооцита, мы хотели знать, может ли такая же модель асимметрии быть унаследована результирующими эмбрионами.Учитывая, что один бластомер двухклеточного эмбриона расщепляется первым, неразборчивое разделение двухклеточных эмбрионов приводит к ограничениям, исключающим возможность того, что асимметрия транскриптома внутри MII-ооцита приводит к запрограммированному наследованию асимметричного транскриптома между бластомерами двухклеточных эмбрионов [4] (пожалуйста, см. рис. 7). Чтобы избежать этого нежелательного смещения, RT-qPCR выполняли между сестринскими бластомерами второго расщепления и оставшимся бластомером первого расщепления (фиг. 2B). Из 12 оцененных транскриптов 9 (75%) транскриптов ( H 19, PCAF , DNMT3A , DNMT1 , STELLA , SOX2 , NANOG , 000 TOU5 и 000 TOU5) показали сравнимую численность между вторыми митотическими продуктами, что свидетельствует об отсутствии доказательств запрограммированного наследования у ранних эмбрионов овец.Несмотря на это, 3 из 12 транскриптов (25%) были асимметрично распределены между сестринскими бластомерами 3-клеточных эмбрионов. Транскрипты NPM2 и GCN были значительно выше по ведущему бластомеру по сравнению с отстающим, тогда как GMNN были значительно выше по отстающему по сравнению с ведущим бластомером.

Рис 7. Важность ориентации эмбриональных отделов.

Расщепление может происходить либо экваториально, либо меридионально, вдоль оси животное-растительность, со ссылкой на веретено MII как гипотетический животный полюс.Результатом экваториального деления первого дробления является асимметрия транскриптома между бальстомерами 2-клеточного эмбриона, которая может сохраняться даже после второго деления дробления. Напротив, результатом меридионального деления первого расщепления является симметрия транскриптома между бальстомерами 2-клеточного и 3-клеточного эмбрионов, несмотря на полярность транскрипта ооцита. Более того, неразборчивое разделение двухклеточных эмбрионов приводит к ограничениям, которые исключают возможность того, что асимметрия транскриптома внутри MII-ооцита ведет к запрограммированному наследованию асимметричного транскриптома между бластомерами двухклеточных эмбрионов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.g007

Общие материнские белки асимметрично распределены в MII-ооците у овцы

Спектрофотометрический анализ градиентов белка (рис. 8A) показал, что общее содержание белка в фрагментах ооцитов S, NS и FS было очень схожим (1,98, 1,67 и 1,68 нг / мкл, соответственно). Несмотря на это, общее содержание белка в субструктурах S + NS (3,65 нг / мкл) было в два раза выше, чем в FS. Более того, учитывая тот факт, что фрагмент ооцита S составляет всего около 2.9% от общего объема ооцита, пропорциональное содержание белка в фрагменте ооцита S можно было оценить примерно в 68,3 нг / мкл, что значительно выше соответствующего содержания белка в аналогах NS и FS (3,5 и 3,4 нг / мкл, соответственно).

Рис. 8.

A) Сравнительный анализ содержания общего белка в субклеточных структурах MII-ооцита. ^a-c: значения с разными верхними индексами значительно различаются при p <0,05. Б) Белковые структуры субструктур ооцитов, выявленные электрофорезом в SDS-PAGE.C) Вестерн-блоттинг NANOG и DNMT3A между фрагментами ооцитов NS + S и FS.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.g008

Общие лизаты белков субструктур ооцитов разделяли электрофоретически по молекулярной массе с помощью SDS-12% PAGE, и белки визуализировали окрашиванием серебром (рис. 8B). Отсутствие периферического мазка на основном крае геля указывало на то, что большинство окрашиваемых белков ооцитов были разделены во время электрофореза SDS-page.Примечательно, что, несмотря на близкое сходство в белковых структурах трех субструктур ооцитов, наблюдались некоторые количественные или качественные различия в белковых структурах на SDS-геле. Например, интенсивности полос белка 170 и 70 кДа в NS были выше, чем у S и FS.

Специфические материнские белки асимметрично распределены в MII-ооцитах овцы

Чтобы убедиться в специфичности антител, иммуноблоттинг был проведен на тканях овцы (семенники и печень) и фибробластах.Полученные данные показали, что из семи антител (SOX2, DNMT3A, DNMT3B, DNMT1, cKIT, OCT4 и NANOG), проверенных на перекрестную реактивность с соответствующими белками овцы, только антитела DNMT3A, DNMT3B и NANOG реагировали с соответствующими белками овцы. Иммуноблоттинг разделенных пополам ооцитов овцы с этими одобренными антителами показал, что белки DNMT3A и NANOG по-разному локализованы в ооцитах MII овцы (S2, фиг.). Соответственно, половина ооцита рядом с веретеном (NS) содержала более высокие уровни материнских белков DNMT3A и NANOG по сравнению с половиной ооцита, которая была расположена далеко от веретена (FS).Хотя DNMT3B должным образом реагировал с тканями овцы (семенники и печень) и фибробластами, ни с разделенными пополам, ни с интактными ооцитами не было получено полосы белка (рис. 8C).

SEP может не определять первую плоскость дробления у эмбрионов овец

Чтобы определить, имеет ли SEP какое-либо отношение с первой плоскостью расщепления, SEP был помечен с использованием дили-мечения зоны. Из 68 проанализированных расколотых яиц только в 3 (4,4%) SEP и плоскость дробления перекрывались. В остальных 65 яйцах топологическое положение первой плоскости спайности относительно SEP было вполне стохастическим.Используя другую партию меченых яиц, мы также не смогли различить тенденцию к локализации SEP в конкретной области этого 3-клеточного эмбриона (данные не показаны).

Распределение цитоплазматических липидов относительно симметрично между сестринскими бластомерами ранних эмбрионов овцы

Липид-специфический флуорохром, нильский красный, использовали для пространственного сравнения содержания липидов в ооците (рис. 9, образцы изображений A-A ») и между бластомерами эмбрионов на двухклеточной стадии (31 эмбрион в 3-х повторах).(Рис. 9, образцы изображений B-C »). Первое наблюдение заключалось в том, что относительная средняя интенсивность флуоресценции сильно различалась между разными эмбрионами. Несмотря на то, что у 40/45 (88,9%) оцениваемых двухклеточных эмбрионов не было существенной разницы между относительной средней интенсивностью флуоресценции двух бластомеров (0,9 ± 0,2 против 1,3 ± 0,3, условные единицы) (Рис.9, образцы изображений ВВ »). У оставшихся 5/45 (11,1%) двухклеточных эмбрионов относительная средняя интенсивность флуоресценции одного бластомера была значительно выше, чем другого (0.6 ± 0,3 против 1,5 ± 0,2 условных единиц) (Рис. 9, образцы изображений C-C »).

Рис. 9. Типичные рисунки и окрашивание Нильским красным для исследования распределения липидных капель с MII-ооцитами (A-A «) и между сестринскими бластомерами 2-клеточного эмбриона (B-C»).

Липидные капли равномерно распределены в MII-ооците (A-A «) и в большинстве двухклеточных эмбрионов (A-A» и D). Однако у некоторых двухклеточных эмбрионов один бальстомер имел значительно более высокие липидные капли (C-C ”и E). Полоса соответствует 100 мкм.*: достоверно отличается при P <0,05.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.g009

Внутрицитоплазматическая инъекция Dil не нарушает деление клеток и развитие эмбриона у овец

Было проанализировано влияние инъекции Dil на выживаемость эмбрионов, деление клеток и развитие эмбрионов. Из 245 овечьих 2-клеточных эмбрионов, которым вводили Dil, у 32 (13,1%) были обнаружены лизированные бластомеры. Тем не менее, соответствующий процент успешно помеченных эмбрионов, которые могли развиться до стадии бластоцисты (37.5%) было сравнимо с фиктивной инъекцией (41,3%) и контролем без инъекции (44,3%). Важно отметить, что порядок деления 2-клеточных бластомеров не зависел от метода мечения, поскольку вероятность деления меченых и немеченых бластомеров первыми была сопоставимой (58,2% (124/213) и 41,8% (89/123), соответственно). .

Потомство ведущего бластомера внесло вклад в большее количество клеток в развитых бластоцистах по сравнению с отстающим аналогом

Из 213 успешно маркированных эмбрионов овец 80 (37.5%) до бластоцисты. В 10 бластоцистах (12,5%) мы не смогли определить точное распределение клеток, полученных из введенного бластомера. Эта неудача была связана с везикулярностью (отсутствие различимой ICM), которая иногда возникает во время продуцирования эмбрионов in vitro у сельскохозяйственных животных [49]. Вклад ведущих и отстающих бластомеров в общее количество клеток сформировавшихся бластоцист был проанализирован на 12 бластоцистах (рис. 10). В большинстве случаев (9/12 = 75,0%) ведущий бластомер вносил вклад в большее количество клеток в развитых бластоцистах по сравнению с отстающими бластомерами (в среднем 69.6 против 50,6 соответственно). В оставшихся бластоцистах общий вклад ведущих и отстающих бластомеров в общее количество сформировавшихся бластоцист был сопоставим (в среднем 53,1 против 46,9 соответственно).

Рис. 10. Вклады ведущих и запаздывающих бластомеров в общее количество клеток в развитых бластоцистах.

В большинстве (75%) бластоцист ведущие бластомеры способствовали значительному увеличению количества клеток бластоцисты по сравнению с отстающими аналогами.В остальных 25% вклады ведущих и отстающих бластомеров в общее количество клеток бластоцист были сопоставимы. *: достоверно отличается при P <0,05.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.g010

Порядок дробления эмбрионов овцы на двухклеточной стадии не определяет вклад ведущих и отстающих бластомеров в эмбрионально-абэмбриональные части сформировавшихся бластоцист у овцы

Был ли помечен ведущий или отстающий бластомер у двухклеточных эмбрионов, только 3.3% развитых бластоцист имели ортогональный угловой угол между флуоресцентными / нефлуоресцентными клетками и экваториальной плоскостью (заданный образец) (рис. 3, таблица 2). Более того, 8,2% развитых бластоцист представляли собой небольшое отклонение (<45 °) в их угловом градусе (полузаданный образец), соотношение, которое существенно не отличалось по сравнению с ортогональной (определенной) группой. Тем не менее, 88,5% развитых бластоцист показали отклонение углового градуса на ≥45 ° (неустановленный рисунок), что было значительно выше, чем в обеих последних группах (рис. 3, табл. 2).

Отслеживание происхождения клонов, полученных из ведущего бластомера (рис. 3, таблица 2), показало, что ни одна (0%) из развитых бластоцист не может представлять собой ортогональный угол отклонения флуоресцентных / нефлуоресцентных клеток от экваториальной плоскости (заданный образец) и только 12,5% развитых бластоцист были отнесены к полуидентифицированным. Напротив, большинство бластоцист (87,5%) представляли большие отклонения в их угловом градусе (неуказанный образец).

Трассировка клонов, полученных из отстающих бластомеров, показала, что 5.4% развитой бластоцисты имели ортогональное угловое отклонение (заданная картина). Интересно, что для всех бластоцист этой категории потомство отстающего бластомера находилось в эмбриональной части, и мы не наблюдали ни одной бластоцисты с абсолютным вкладом отстающего бластомера в TE. Более того, 5,4% эмбрионов были отнесены к категории полузаданных на основании их отклоненного углового вылета. Напротив, большинство бластоцист (91,9%) были классифицированы как неопределенные на основании вклада их отстающих бластомеров в области Em-Ab (рис. 3, таблица 2).

Относительное равенство в развитии соответствующих сестринских бластомеров, полученных из двухклеточных эмбрионов овцы

Всего 456 эмбрионов ЭКО на 2-клеточной стадии из 6 повторов были использованы для разделения сестринских бластомеров. Средняя частота успеха разделения сестринских бластомеров, оцениваемая по возможности получить два интактных бластомера, была очень высокой (> 93%). Пилотное исследование показало, что развитие in vitro эмбрионов на 2-клеточной стадии без зоны было незначительно ниже, чем у аналогов без зоны (31.5 ± 8,6 против 36,7 ± 5,9% соответственно). На рис.11 показана взаимосвязь между способностью данного бластомера к развитию до определенной стадии развития (ось Y: 2CB, 2-клеточный блок; 4CB, 4-клеточный блок; 8CB, 8-клеточный блок; MB: блок морулы; BLS. , бластоциста) и его сестринский бластомер (ось X: 2CB, 2-клеточный блок; 4CB, 4-клеточный блок; 8CB, 8-клеточный блок; MB: блок морулы; BLS, бластоциста). Как показано, пропорции двухклеточных эмбрионов овец, у которых оба сестринских бластомера прекращали развитие до стадии бластоцисты (2CB, 4CB, 4CB и MB) или достигли стадии бластоцисты (BLS), составляли 35.5, 26,3, 28,5, 46,8 и 39,6% соответственно. Вероятность того, что один сестринский бластомер прекратил развитие до стадии бластоцисты (на стадии 2CB, 4CB, 4CB или MB), в то время как другой сестринский бластомер достиг стадии бластоцисты, составляла 16%. Кумулятивная вероятность того, что один бластомер развил одну или несколько стадий дальше, чем соответствующий сестринский бластомер, составляла 43,9%. Сходным образом, кумулятивная вероятность того, что один бластомер развил одну или несколько стадий раньше, чем соответствующий сестринский бластомер, составляет 36.1%.

Рис. 11. Компетенция развития соответствующих сестринских бластомеров, полученных из двухклеточных эмбрионов овцы.

Доля сестринских бластомеров, которые развились до определенных стадий развития (ось Y: 2-клеточный блок (2CB), два дальнейших расщепления (4-клеточный блок: 4CB), три дальнейших расщепления (8-клеточный блок: 8CB), четыре дальнейших расщепления (блок морулы: MB) и те бластомеры, которые достигли стадии бластоцисты (BLS)). Размер кружков соответствует их относительным пропорциям (числам внутри кружков).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.g011

Discussion

Полярность ооцитов и формирование эмбрионального паттерна — хорошо установленные особенности развития у низших видов [1]. Существуют ли сходные формы предварительного формирования паттерна у млекопитающих, в настоящее время ведутся горячие споры у мышей [50]. У свиней два исследования предоставили доказательства формирования паттерна эмбрионов в связи со смещенным распределением цитоплазматических липидов и митохондрий между 2-клеточными бластомерами [34, 35].Впервые у овец мы предоставили доказательства пространственного распределения общих и специфических транскриптов и белков в неоплодотворенных ооцитах MII. Важно отметить, что направление и ориентация пространственного расположения транскриптов и белков соответствовали положению веретена MII и четко идентифицировали два полушария, относительно сопоставимые с наблюдаемыми ооцитами Xenopus . Анализ оплодотворенных ооцитов также показал явное смещение в предпочтительном месте входа сперматозоидов в MII-ооциты овцы.Эти результаты согласуются с некоторыми исследованиями на мышах [4, 51, 52], что может свидетельствовать о существовании животно-вегетативной оси внутри ооцитов млекопитающих. Тем не менее, не наблюдалось значительной разницы между количеством транскриптов 2-клеточных бластомеров, что указывает на то, что полярность транскрипции неоплодотворенных ооцитов не сохраняется после оплодотворения. Следовательно, необходимо различать возможную временную поляризацию материнских мРНК и белков в неоплодотворенных ооцитах овоцитов и истинную полярность, наблюдаемую в ооцитах более низких видов, таких как ооциты Xenopus [33].В отличие от гипотезы предварительного формирования паттерна, мы не наблюдали никакой взаимосвязи между порядком деления 2-клеточных бластомеров и паттерном распределения клеток в ICM и TE бластоцист овцы. Более того, наблюдалось относительное равенство между способностью к развитию данного бластомера двухклеточных эмбрионов и его сестринского бластомера развиваться до определенной стадии развития in vitro. Следовательно, в то время как асимметрия транскриптов и белков внутри неоплодотворенных ооцитов предоставила доказательства в поддержку предварительного формирования паттерна у млекопитающих, отслеживание линеек ранних расщепленных бластомеров предоставило доказательства против этой гипотезы.

Растворимый в мембранах флуоресцентный краситель Dil был использован для отслеживания клеточного происхождения эмбрионов на двухклеточной стадии [9]. Однако для эмбрионов овцы на 2-клеточной стадии мы не могли маркировать эмбрионы путем позиционирования красителя на клеточной мембране. В отличие от мышей, ооциты и зародыши копытных животных имеют непрозрачный или темный вид из-за характерного для них большого скопления липидных капель и гранул [34, 35, 40]. Эта обогащенная липидами цитоплазма может препятствовать простому всасыванию растворенного в масле Dil плазматической мембраной.Таким образом, интрацитоплазматическая инъекция Dil использовалась для мечения двухклеточных эмбрионов овцы, что согласуется с исследованием Park et al. [35] у свиней. Полученные результаты показали, что, хотя общая скорость развития инъецированных эмбрионов была ниже, чем неинъекционных эмбрионов, вероятность деления меченых и немеченых бластомеров первыми была равной, что позволяет предположить, что порядок деления не зависит от метода маркировки.

В 75% оплодотворенных ооцитов точка входа сперматозоидов находилась в полушарии мейотического веретена.Этот показатель выше, чем случайный показатель, равный 50%. Важно отметить, что распределение SEP в MII-половине не было случайным, поскольку любая (0%) головка сперматозоида наблюдалась в зоне-I, которая составляет 16,7% области, ближайшей к мейотическому веретену. Это наблюдение согласуется с исследованиями Hiiragi и Solter [16] и Motosugi et al. [18] у мышей. SEP не был связан с наличием клеток кумулюса, поскольку те же результаты были получены, когда клетки кумулюса-короны были диспергированы перед ЭКО (данные не показаны). Таким образом, предпочтительный SEP, наблюдаемый в зиготах овец, напоминает теорию внутренней полярности ооцитов млекопитающих, утвержденную рядом исследователей, включая Gardner et al.[8] и Пиотровска и Зерницка-Гетц [10]. Эти исследователи продемонстрировали, что первая плоскость дробления и ось эмбриона у мышей могут быть определены с учетом расположения 2-pb и SEP. В этой схеме бластомер в 2-клеточном эмбрионе, который наследует SEP, будет делиться раньше, чем др., И вносить вклад преимущественно в клон ICM [10]. Напротив, другие исследователи полагают, что ооциты мышей асимметричны в паттерне распределения цитоплазматических компонентов, и это не дает ключа к разгадке полярности ооцита или предпочтительного SEP [16].Примечательно, что Motosugi et al. [18] продемонстрировали, что 2-pb перемещается в сторону первой плоскости расщепления, и предпочтение SEP по отношению к MII-половине обусловлено пространственной асимметрией перивителлинового пространства под 1-pb. Соответственно, вероятность SEP была по существу случайной после удаления зоны, что свидетельствует об отсутствии наследственного предпочтения SEP в ооцитах мышей [18]. Более того, при вращении эмбриона внутри зоны Kurotaki et al. [26] предоставили доказательства, показывающие, что как граница между двухклеточными бластомерами, так и ось Em-Ab бластоцисты совпадают относительно эллипсоидальной формы zona pelucida.Мы также наблюдали объективный SEP в ооцитах овцы, когда зона была удалена перед ЭКО (данные не показаны), что свидетельствует об отсутствии предпочтительного SEP в ооцитах овцы. Дальнейшие исследования необходимы для выяснения роли зоны, перивителлинового пространства и SEP в зиготе овец и других видов.

По сравнению с другими видами млекопитающих ооциты и эмбрионы сельскохозяйственных животных характеризуются высоким содержанием липидов, которые хранятся в основном в виде липидных капель в цитоплазме [53]. Помимо их роли в энергетическом метаболизме во время созревания ооцитов и развития эмбрионов [54], асимметричное распределение липидных капель, как предполагается, участвует в выделении клонов у Sminthopsis macroura эмбрионов [55].Смещение содержания липидов в эмбрионах свиней на двухклеточной стадии наблюдалось Kim et al. (2012) [34]. Последняя группа продемонстрировала, что бластомеры, возникающие из бластомеров, обогащенных липидами, в 2 раза чаще формируют эмбриональную часть, чем абэмбриональную часть, тогда как вклад более ярких бластомеров (без липидов) прямо противоположен [34]. Мы наблюдали, что у большинства овечьих эмбрионов на двухклеточной стадии относительные средние интенсивности флуоресценции обоих бластомеров были сопоставимы и только у 11.У 1% эмбрионов наблюдалась значительная систематическая ошибка в распределении липидных капель между двумя бластомерами. Отслеживание клонов бластомеров, обогащенных липидами, и бластомеров без липидов не выявило явной корреляции между содержанием липидов и формированием эмбриональной оси у эмбрионов на двухклеточной стадии овец (данные не показаны). В этом противоречии могут быть замешаны видовые различия.

В то время как регионализация транскриптомов является существенной детерминантой полярности у многоклеточных животных [4], один важный вопрос заключается в том, хранятся ли эти генные продукты симметрично по всему ооциту или такая же асимметрия транскриптов ооцитов у низших видов существует в неоплодотворенных яйцах млекопитающих.Чтобы ответить на этот вопрос, мы сравнили количество транскриптов генов, участвующих в плюрипотентности и эпигенетическом репрограммировании между 3 субклеточными структурами, полученными микрохирургическим путем из MII-ооцитов овцы: кортикальный материал, содержащий материал веретена MII (S), и половинки ооцита, которые либо близки к (NS) или далеко от (FS) шпинделя MII. Первый подчеркнутый момент заключался в том, что общее содержание мРНК половин FS было значительно выше, чем у NS или S, но вполне сопоставимо с NS + S, что предполагает симметричные градиенты мРНК между двумя половинами MII-ооцита.Несмотря на то, что, поскольку S-компартменты составляют минутный объем (≈2–5% от объема интактного ооцита), пропорциональное количество материнской мРНК, ограниченное S, находится в диапазоне от 10 до 80 раз от FS, что отражает явную систематическую ошибку. пространственное разделение обогащения материнской мРНК в ассоциации с MII-хромосомами у овец. Достаточно интересно, что количественное сравнение обилия транскриптов показало, что компартменты S, NS и FS MII-ооцита имеют различимые профили мРНК. Почти все транскрипты, которые преимущественно присутствовали в S- или NS-компартментах, принадлежали генам, участвующим в эпигенетической регуляции плюрипотентности и импринтинга.Эти результаты совместимы с ролью транскрипционной реорганизации сортировки мРНК как прелюдии к установлению судьбы клетки позже в бластоцисте [4, 7, 56].

Используя микроматричный анализ парных микрохирургических образцов веретена и остатков из ооцитов и зигот мышей, VerMilyea et al. [4] показали, что неоплодотворенные MII-ооциты обладают различимыми профилями. Важно отметить, что они продемонстрировали, что хотя значительная погрешность в профилях транскриптомов зиготы и ассоциированного с ней обогащенного веретеном второго полярного тельца все еще была различима после оплодотворения, такая транскрипционная асимметрия не сохранялась между сестринскими клетками внутри 2 или 3 клеточных эмбрионов.Таким же образом Роберт и др. [57] продемонстрировали, что, хотя содержание транскриптов варьировалось как у отдельных эмбрионов, так и у двойных бластомеров, для большинства генов не наблюдалось устойчивой асимметрии. Следовательно, в соответствии с этими двумя последними исследованиями, мы наблюдали, что начальная транскрипционная асимметрия, существующая в MII-ооцитах, может не сохраняться через ранние дробления зиготы и эмбриона. Как асимметрия транскриптома, которую мы наблюдали в MII-ооцитах овцы (это исследование), а также в MII-ооцитах и зиготах мыши [4], могла быть устранена в ходе первого дробления эмбриона? Хотя точный ответ еще предстоит понять, он может быть связан с ориентацией первого и второго эмбриональных отделов, экваториальной или меридиональной, вдоль животно-вегетативной оси, со ссылкой на веретено MII как гипотетический животный полюс (рис. 3). .Результатом экваториального деления первого дробления является асимметрия транскриптома между бальстомерами 2-клеточного эмбриона, которая может сохраняться даже после второго деления дробления. Напротив, результатом меридионального деления первого расщепления является симметрия транскриптома между бальстомерами 2-клеточного и 3-клеточного эмбрионов, несмотря на полярность транскрипта ооцита.

У низших позвоночных и беспозвоночных полярность эмбриона, которая лежит в основе будущего строения тела, ожидается до оплодотворения за счет полярного распределения белковых доменов и градиентов их концентрации внутри яйца [58].Также документально подтверждено пространственное распределение белков в животном и растительном полюсах ооцитов / яиц амфибий [59, 60]. Однако млекопитающие, похоже, являются исключением. Например, у мышей ооцит считается «асимметричным», но «неполяризованным» [18]. В том же смысле обычно считается, что полярность эмбриона устанавливается после имплантации, а не до / во время оплодотворения [16,18]. Хотя некоторые исследования полагают, что та же самая модель полярности ооцитов амфибий существует у млекопитающих и, следовательно, полярность эмбриона может быть прослежена до организации яйца [51, 61, 52, 62].Пока нет исследований, в которых изучалась бы возможная регионализация общего белка у млекопитающих, за исключением нескольких исследований, которые описывали пространственную перестройку некоторых уникальных белков внутри ооцитов мыши [25, 62]. Мы описали здесь, что материнские белки пространственно разделены внутри неоплодотворенных овоцитов и сильно ограничены MII-хромосомами. Важно отметить, что иммуноблоттинг показал, что специфические материнские белки, такие как DNMT3A и NANOG, также были асимметрично обогащены в MII-половине веретена ооцитов.Эти результаты могут предоставить первое предварительное доказательство того, что на ключевые события раннего развития млекопитающих, такие как формирование оси эмбриона и обязательство первого клона, может влиять запас материнских белков, которые были унаследованы ооцитом до оплодотворения.

Отслеживание происхождения меченых эмбрионов овец продемонстрировало, что, хотя потомство быстрого 2-клеточного бластомера способствовало увеличению количества клеток в развитых бластоцистах по сравнению с отстающими бластомерами, потомство, полученное от ведущих / быстрых и отстающих / медленных бластомеров, не имеет специфических судьба и их распределение не определяют эмбрионально-абэмбриональную полярность бластоцисты.Эти данные контрастируют с соответствующими исследованиями на свиньях [34, 35] и мышах [5, 8, 9, 10, 11], но согласуются с некоторыми другими исследованиями на мышах в полевых условиях [12, 13, 15, 16, 17 18]. Важно отметить, что наблюдалось относительное равенство между способностью к развитию данного бластомера 2-клеточного эмбриона и его сестринского бластомера развиваться до определенных стадий развития in vitro (2-клеточный блок, 4-клеточный блок, 8-клеточный блок, блок морулы или бластоциста). В аналогичном исследовании крупного рогатого скота Held et al.[46] показали общий коэффициент корреляции 73% с точки зрения развития in vitro раздельных сестринских бластомеров крупного рогатого скота. Несмотря на то, что видоспецифические различия в механизме развития эмбрионов могут помешать прямому сравнению этих исследований, и, следовательно, подразумевается, что каждый вид следует рассматривать отдельно от других видов.

Наиболее важным фактором, влияющим на компетентность ооцитов, является наследие фолликулярной среды до возобновления мейоза, которое обеспечивает полную поддержку во время ранних эмбриональных событий до широкой активации эмбрионального генома [63].В современной модели оогенеза млекопитающих, однако, этот огромный материнский запас генерируется внутренне, когда ооцит достигает своего полного размера в фолликуле [64]. Однако совсем недавно Macaulay et al. [65] предоставили доказательства синапсоподобной связи везикулярного транспорта, которая поддерживает избирательный перенос больших молекул, таких как транскрипты, из кумулюсных клеток в полностью выросший ооцит крупного рогатого скота. Учитывая этот неожиданный вклад кумулюсных клеток в материнские запасы, было бы интересно узнать, могут ли наблюдаемые полярности транскриптов [4, 57] и белков (это исследование) в ооцитах млекопитающих быть связаны с одинаковыми уровнями функциональной полярности окружающие кучевые клетки.

Классически, после разделения бластомеров эмбриона на двухклеточной стадии, каждый бластомер может часто развиваться до бластоцисты и до термина [66, 6, 15, 29, 67, 68, 69]. Эта высокая степень пластичности развития подтверждает предположение, что раннее эмбриональное развитие у млекопитающих, в отличие от развития других видов, является стохастическим [30]. Знание о пластичности развития, с которой эмбрионы адаптируются к экспериментальным возмущениям, открывает многообещающие возможности для размножения животных со сходным генетическим фоном для исследований, биомедицины и сельского хозяйства.Тем не менее, в более ранних и недавних работах есть указания на то, что отрицание универсальности пластичности развития при условии, что монозиготное сплетение этим методом расщепления эмбриона практически недостижимо [29, 30, 70, 71]. Это может быть объяснено данными о том, что даже если отдельные бластомеры двухклеточного эмбриона могут развиться в бластоцисту, очень небольшое количество беременностей или отсутствие беременности может привести к доношенному рождению монозиготных близнецов этим путем, что предполагает предвзятую компетентность в развитии двухклеточного эмбриона. бластомеры [29, 30].Несмотря на то, что из-за непредвзятого вклада двухклеточных бластомеров овцы, установленного в этом исследовании, и более ранней работы по монозиготному спариванию у овец [67], можно утверждать, что раннее развитие эмбриона у овец, в отличие от низших животных, таких как Xenopus и . Drosophila является как стохастическим, так и регуляторным.

Заключение

Насколько нам известно, это исследование является первым, описывающим поляризованное распределение некоторых материнских транскриптов и общих материнских белков в неоплодотворенных ооцитах овцы.Эти находки могут предполагать, что на некоторые ключевые события раннего развития млекопитающих, такие как формирование эмбриональной оси и обязательство первого клона, может влиять запас материнских белков, которые были унаследованы ооцитом до оплодотворения. Эти результаты могут иметь отношение к низкой компетентности в развитии SCNT-эмбрионов, у которых такой большой источник материнских мРНК и белков удаляется во время энуклеации ооцитов. Более того, может потребоваться уточнение некоторых манипулятивных и диагностических методов.Возможно, например, жизнеспособность эмбрионов после ИКСИ может иметь клиническое значение в зависимости от места инъекции сперматозоидов; при условии, что зрелые ооциты овцы имеют преимущественное проникновение сперматозоидов очень близко к материнским хромосомам, хотя эта тенденция, как было обнаружено, связана с зоной. Несмотря на это, мы наблюдали доказательства симметрии транскрипта и беспристрастного вклада 2-клеточных бластомеров в ICM и TE. Более того, наблюдалось относительное равенство между способностью развития данного бластомера двухклеточных эмбрионов и его сестринского бластомера развиваться до определенных стадий развития.Эти данные вместе с другими данными сравнимой компетентности в развитии двухклеточных бластомеров могут подчеркивать потенциальное использование и клиническую значимость сестринского бластомера разделенного на две части двухклеточного эмбриона для монозиготного спаривания [30, 31], создания аутологичных ESC [30], и прогнозирование компетентности в развитии соответствующего сестринского бластомера [46]. Следовательно, даже если неоплодотворенный ооцит овцы можно считать полярным в отношении пространственной регионализации материнской мРНК и белков, основные силы этой окончательной оси полярности могут не сохраняться во время эмбриональных расщеплений.В этом смысле развитие эмбриона и формирование эмбриональной оси не может быть прослежено до событий до оплодотворения.

Дополнительная информация

S1 Рис. Оценка качества РНК.

Для оценки целостности общей РНК аликвоту каждого образца РНК обрабатывали на денатурирующем агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. Прогон интактной общей РНК на денатурирующем геле имел четкие, четкие полосы 28S и 18S рРНК, что указывает на качество РНК.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.s001

(TIF)

S2 Рис. Специфичность антител.

Иммуноблоттинг проводился на тканях (семенники и печень) и фибробластах овцы. Полученные данные показали, что среди семи антител (SOX2, DNMT3A, DNMT3B, DNMT1, cKIT, OCT4 и NANOG) проверена перекрестная реактивность с соответствующими белками овцы. Только антитела DNMT3A, DNMT3B и NANOG реагировали с соответствующими белками овцы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.s002

(TIF)

Благодарности

Авторы искренне благодарят С. Остадхоссейни и Ф. Газвини Задеган из отделения эмбриологии Института Рояна за технический вклад в эту работу.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: SMH AS MHNE. Проведены эксперименты: SMH FM NTV VA MAD NJ AS HG AHS AVD HRG. Проанализированы данные: СМХ ВА. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: MHNE HG. Написал статью: SMH AS MHNE.

Ссылки

1. Эдвардс Р.Г., Борода HK. Полярность ооцитов и определение клеток у ранних эмбрионов млекопитающих. Молекулярная репродукция человека. 1997; 3: 863–905. pmid: 9395264
2. Зерницка-Гетц М, Моррис С.А., Брюс А.В. Принятие твердого решения: многогранная регуляция судьбы клеток раннего эмбриона мыши. Природа Обзоры Генетики. 2009; 10: 467–77. pmid: 19536196
3. Веннекамп С., Мезеке С., Неделек Ф., Хиираги Т. Каркас самоорганизации для нарушения симметрии в эмбрионе млекопитающих.Обзоры природы Молекулярная клеточная биология. 2013; 14: 452–9. pmid: 23778971
4. VerMilyea MD, Maneck M, Yoshida N, Blochberger I, Suzuki E, Suzuki T и др. Асимметрия транскриптома внутри зигот мышей, но не между ранними эмбриональными сестринскими бластомерами. Журнал Европейской организации молекулярной биологии. 2011; 30: 1841–51.
5. Гарднер Р. Ранняя бластоциста билатерально симметрична, и ее ось симметрии совпадает с животно-вегетативной осью зиготы у мыши.Разработка. 1997; 124: 289–301. pmid:
06
6. Тарковский А.К. Эксперименты по развитию изолированных бластомеров яиц мышей. Природа. 1959; 184: 1286–7. pmid: 13836947
7. Johnson MH, Ziomek CA. Основа двух различных клеточных линий морулы мыши. Клетка. 1981; 24: 71–80. pmid: 7237545
8. Гарднер Р. Спецификация осей эмбриона начинается до расщепления при нормальном развитии мыши. Разработка. 2001: 128: 839–47.pmid: 11222139
9. Piotrowska K, Wianny F, Pedersen RA, Zernicka-Goetz M. Бластомеры, возникающие в результате первого деления дробления, имеют различную судьбу в нормальном развитии мышей. Разработка. 2001; 128: 3739–48. pmid: 11585800
10. Пиотровска К., Зерницка-Гетц М. Роль сперматозоидов в формировании пространственного паттерна раннего эмбриона мыши. Природа. 2001; 409: 517–21. pmid: 11206548
11. Зерницка-Гетц М. Характер дробления и возникающая асимметрия эмбриона мыши.Nat Rev Mol Cell Biol. 2005; 6: 919–28. pmid: 16341078
12. Аларкон В.Б., Марикава Ю. Отклонение оси бластоцисты от первой плоскости дробления не влияет на качество постимплантационного развития мышей. Биол Репрод. 2003; 69: 1208–12. pmid: 12773417
13. Аларкон В.Б., Марикава Ю. Беспристрастный вклад первых двух бластомеров в развитие бластоцист у мышей. Mol Reprod Dev. 2005; 72: 354–61 pmid: 16078274
14. Аларкон В.Б., Марикава Ю.Пространственное выравнивание оси бластоцисты мышей поперек первой плоскости дробления вызвано скорее механическими ограничениями, чем смещением развития среди бластомеров. Mol Reprod Dev. 2008; 75: 1143–53. pmid: 18196554
15. Chroscicka A, Komorowski S, Maleszewski M. Оба бластомера двухклеточного эмбриона мыши вносят вклад в эмбриональную часть бластоцисты. Mol Reprod Dev. 2004; 68: 308–12. pmid: 15112323
16. Hiiragi T, Solter D. Первая плоскость деления яйца мыши не предопределена, но определяется топологией двух соприкасающихся пронуклеусов.Природа. 2004; 430: 360–4. pmid: 15254539
17. Louvet-Vallée S, Vinot S, Maro B. Митотические веретена и плоскости дробления ориентированы случайным образом в двухклеточном эмбрионе мыши. Curr Biol. 2005; 15: 464–9. pmid: 15753042
18. Motosugi N, Dietrich J-E, Polanski Z, Solter D, Hiiragi T. Космическая асимметрия направляет предпочтительное проникновение сперматозоидов в ооцит мыши при отсутствии полярности. PLoS Biol. 2006; 4 e135. pmid: 16620153
19. Waksmundzka M, Wiśniewska A, Maleszewski M.Распределение клеток в бластоцисте мыши не определяется порядком расщепления первых двух бластомеров. Биол Репрод. 2006; 75: 582–7. pmid: 16822899
20. Нюсслейн-Фольхард К. Определение эмбриональных осей дрозофилы. Разработка. 1991; 113: 1–10.
21. Herr JC, Chertihin O, Digilio L, Jha KN, Vemuganti S, Flickinger CJ. Распределение РНК-связывающего белка MOEP19 в коре ооцитов и ранних эмбрионах указывает на предварительное формирование паттерна, связанное с полярностью бластомера и спецификацией трофэктодермы.Dev Biol. 2008; 314: 300–16. pmid: 18191828
22. Макара И.Г., Мили С. Полярность и различная наследственность — универсальные атрибуты жизни? Клетка. 2008; 135: 801–12. pmid: 146
23. Джонсон MH, нетерпеливый D, Muggleton-Harris A, Grave HM. Мозаицизм в организации рецепторов конканавалина А на поверхностной мембране яйца мыши. Природа. 1975; 257: 321–2. pmid: 1172195
24. Дункан Ф.Э., Мосс С.Б., Шульц Р.М., Уильямс С.Дж.. PAR-3 определяет центральный субдомен кортикального актинового колпачка в яйцах мышей.Dev Biol. 2005; 280: 38–47. pmid: 15766746
25. Antczak M, Van Blerkom J. Влияние ооцитов на раннее развитие: регуляторные белки лептин и STAT3 поляризованы в ооцитах мыши и человека и по-разному распределяются в клетках эмбриона доимплантационной стадии. Мол Хум Репрод. 1997; 3: 1067–86. pmid: 9464852
26. Kurotaki Y, Hatta K, Nakao K, Nabeshima Y-i, Fujimori T. Ось бластоцисты определяется независимо от раннего клеточного клона, но совпадает с формой ZP.Наука. 2007; 316: 719–23. pmid: 17446354
27. Ван дер Вестерлакен Л.А., Хельмерхорст Ф.М., Херманс Дж., Наактгеборен Н. Внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоидов: положение полярного тела влияет на частоту наступления беременности. Hum Reprod. 1999; 14: 2565–9. pmid: 10527988
28. Мулави Ф., Хоссейни С.М., Хаджиан М., Форузанфар М., Абеди П., Остадхоссейни С. и др. Метод переноса ядра влияет на количество мРНК, компетентность в развитии и судьбу клеток восстановленных ооцитов барана.Репродукция. 2013; 145: 345–55. pmid: 23401598
29. Миталипов С.М., Йоман Р.Р., Куо Х.С., Вольф Д.П. Монозиготное спаривание у макак-резусов путем манипуляции с эмбрионами, полученными in vitro. Биол Репрод. 2002; 66: 1449–55. pmid: 11967209
30. Morris SA, Guo Y, Zernicka-Goetz M. Пластичность развития связана с плюрипотентностью и сигнальными путями Fgf и Wnt. Cell Rep.2012; 2: 756–65. pmid: 23041313
31. Taei A, Hassani SN, Eftekhari-Yazdi P, Rezazadeh Valojerdi M, Nokhbatolfoghahai M, et al.Повышенная генерация человеческих эмбриональных стволовых клеток из отдельных бластомеров нормальных и некачественных эмбрионов с дроблением путем ингибирования киназы гликогенсинтазы β и передачи сигналов Rho-ассоциированной киназы. Hum Reprod. 2013; 28: 2661–71. pmid: 23925393
32. Ли Э., Иллингворт П., Уилтон Л., Чемберс Г.М. Клиническая эффективность преимплантационной генетической диагностики анеуплоидии во всех 24 хромосомах (PGD-A): систематический обзор. Hum Reprod. 2014; pii: deu303.
33. Фулька-младший, Карникова Л., Мур Р.М.Полярность ооцитов: ИКСИ, клонирование и родственные методы. Hum Reprod. 1998; 13: 3303–5. pmid: 9886503
34. Kim K, Park S, Roh S. Богатые липидами бластомеры на двухклеточной стадии партенотов свиней демонстрируют предвзятость в отношении вклада в эмбриональную часть. Anim Reprod Sci. 2012; 130: 91–8. pmid: 22277840
35. Park SK, Won C, Choi Y-J, Kang H, Roh S. Ведущий бластомер партеногенетического эмбриона свиньи на 2-клеточной стадии сначала вносит вклад в абэмбриональную часть.J Vet Med Sci. 2009; 71: 569–76. pmid: 19498281
36. McMillen IC. Овца — идеальная модель для биомедицинских исследований? Новости ANZCCART. 2001; 14 (2).
37. Барри Дж. С., Энтони Р. В.. Беременная овца как модель беременности человека. Териогенология. 2008; 69: 55–67. pmid: 17976713
38. Хатиб Х. Эпигенетика животноводства. Джон Уайли и сыновья. 2012.
39. Хоссейни С.М., Мулави Ф., Хаджиан М., Абеди П., Форузанфар М., Остад-Хоссейни С. и др.Высокоэффективное производство бластоцисты крупного рогатого скота in vitro в бесклеточной последовательной синтетической жидкости яйцевода по сравнению с системой совместного культивирования клеток TCM 199 Vero. IJFS. 2008; 2: 66–73.
40. Хоссейни С.М., Мулави Ф., Асгари В., Ширази А., Абазари-Киа А.Х., Ганаи Х.Р. и др. Простой, быстрый и эффективный метод ручной энуклеации ооцитов с использованием вытянутой пипетки Пастера. In vitro Cell Dev Biol Anim. 2013; 49: 569–75. pmid: 23824953
41. Шурманн А., Уэллс Д.Н., Обак Б.Ранние зиготы являются подходящими реципиентами для переноса соматических ядер крупного рогатого скота и приводят к клонированию потомства. Репродукция. 2006; 132: 839–48. pmid: 17127744
42. Риенци Л., Убальди Ф., Мартинес Ф., Якобелли М., Минаси М., Ферреро С. и др. Взаимосвязь между расположением мейотического веретена относительно положения полярного тельца и потенциалом развития ооцита после ИКСИ. Hum Reprod. 2003; 18: 1289–93. pmid: 12773461
43. Hardarson T, Lundin K, Hamberger L. Положение веретена метафазы II нельзя предсказать по положению первого полярного тельца в ооците человека.Hum Reprod. 2000; 15: 1372–6. pmid: 10831572
44. Genicot G, Leroy JL, Soom AV, Donnay I. Использование флуоресцентного красителя, нильского красного, для оценки содержания липидов в отдельных ооцитах млекопитающих. Териогенология. 2005; 63: 1181–94. pmid: 15710202
45. Лю З., Хай Т., Дай Икс, Чжао Х, Ван И, Брошард В. и др. Раннее формирование паттерна клонированных эмбрионов мыши способствует постимплантационному развитию. Dev Biol. 2012; 368: 304–11. pmid: 22659081
46. Held E, Salilew-Wondim D, Linke M, Zechner U, Rings F, Tesfaye D, et al.Отпечаток транскриптома бластомеров 2-клеточной стадии крупного рогатого скота напрямую коррелирует с индивидуальной способностью к развитию соответствующего сестринского бластомера. Биол Репрод. 2012; 87: 154. pmid: 23136300
47. Хоссейни С.М., Асгари В., Остадхоссейни С., Хаджиан М., Ганаей Х.Р., Наср-Исфахани М.Х. Компетенция развития ооцитов овцы после витрификации: дифференциальные эффекты этапов витрификации, методы продуцирования эмбрионов и происхождение пронуклеусов от родителей. Териогенология.2014; 83 (3): 366–76. pmid: 25468553
48. Шмитген Т.Д., Ливак К.Дж. Анализ данных ПЦР в реальном времени сравнительным методом C (T). Nat Protoc. 2008; 3: 1101–8. pmid: 18546601
49. Van Soom A, Ysebaert MT, de Kruif A. Взаимосвязь между временем развития, морфологией морулы и распределением клеток по внутренней клеточной массе и трофэктодерме в эмбрионах крупного рогатого скота, продуцированных in vitro. Mol Reprod Dev. 1997; 47: 47–56. pmid:
14
50. Хиираги Т., Аларкон В.Б., Фухимори Т., Луве-Валле С., Малешевски М., Марикава Ю. и др.Где мы сейчас находимся? — Встреча по формированию паттерна ранних эмбрионов мышей во Фрайбурге, Германия (2005). Int J Dev Biol. 2006; 50: 581. pmid: 16892171
51. Гарднер Р.Л. Взбитые или разделенные пополам яйца мыши и основа формирования паттерна у млекопитающих. Биологические исследования. 1999; 21: 271–4. pmid: 10377889
52. Цимерих М.А., Меснард Д., Зерницка-Гетц М. Животный и растительный полюсы яйца мыши предсказывают полярность эмбриональной оси, но не являются существенными для развития. Разработка.2000; 127: 3467–74. pmid: 10
2
53. Гайда Б. Факторы и методы улучшения качества ооцитов и эмбрионов свиней и их применение в репродуктивной биотехнологии. Репрод Биол. 2009; 9: 97–112. pmid: 19734950
54. Kikuchi K, Ekwall H, Tienthai P, Kawai Y, Noguchi J, Kaneko H, et al. Морфологические особенности перехода липидных капель при оплодотворении ооцитов свиней и раннем эмбриональном развитии в бластоцисты in vivo и in vitro. Зигота. 2002; 10 (4): 355–66.pmid: 12463532
55. Au PCK, Селвуд Л., Фамилари М. Клонирование и характеристика нового гена из семейства белков PAT, у сумчатых, полосатый дуннарт (Sminthopsis macroura). Mol Reprod Dev. 2010; 77: 373–83. pmid: 20140966
56. Ducibella T, Андерсон Э. Форма клеток и изменения мембран в восьмиклеточном эмбрионе мыши: предпосылки для морфогенеза бластоцисты. Dev Biol. 1975; 47: 45–58. pmid: 173595
57. Робертс Р.М., Катаяма М., Магнусон С.Р., Фалдуто М.Т., Торрес К.Э.Профилирование транскриптов отдельных бластомеров-близнецов, полученных путем разделения мышиных эмбрионов на двухклеточной стадии. Биол Репрод. 2011; 84: 487–94. pmid: 21076082
58. Марлоу Флорида. Материнский контроль развития позвоночных: моя мать заставила меня это сделать! Полярность ооцитов и оси эмбрионов: тело Бальбиани, асимметрия древних ооцитов. Сан-Рафаэль (Калифорния): Morgan & Claypool Life Sciences. 2010.
59. Моен Т.Л., Наменвирт М. Распределение растворимых белков вдоль животно-вегетативной оси яиц лягушки.Dev Biol. 1977; 58: 1–10. pmid: 559599
60. Jäckle H, Eagleson GW. Пространственное распределение обильных белков в ооцитах и оплодотворенных яйцах мексиканского аксолотля (Ambystoma mexicanum). Dev Biol. 1980; 75 (2): 492–9. pmid: 7372013
61. Weber RJ, Pedersen RA, Wianny F, Evans MJ, Zernicka-Goetz M. Предполагается полярность эмбриона мыши перед имплантацией. Разработка. 1999; 126: 5591–8. pmid: 10572036
62. Vinot S, Le T, Maro B, Louvet-Vallée S.Два белка PAR6 становятся асимметрично локализованными во время установления полярности в ооцитах мыши. Curr Biol. 2004; 14: 520–5. pmid: 15043819
63. Sirard MA. Факторы, влияющие на транскриптомы ооцитов и эмбрионов. Reprod Domest Anim. 2012; 4: 148–55.
64. Bouniol-Baly C, Hamraoui L, Guibert J, Beaujean N, Szöllösi MS, Debey P. Дифференциальная транскрипционная активность, связанная с конфигурацией хроматина в полностью выросших ооцитах зародышевых пузырьков мыши. Биол Репрод.1999; 60: 580–7. pmid: 10026102
65. Macaulay AD, Gilbert I, Caballero J, Barreto R, Fournier E, Tossou P, et al. Гаметический синапс: перенос РНК в ооцит крупного рогатого скота. Биол Репрод. 2014; 91 (4) 90. pmid: 25143353
66. Николас Дж.С., Холл Б.В. Эксперименты по развивающимся крысам. II. Развитие изолированных бластомеров и сросшихся яиц. J. Exp. Zool. 1942; 90: 441–59.
67. Willadsen SM. Жизнеспособность ранних стадий дробления, содержащих половину нормального количества бластомеров у овец.J Reprod Fertil. 1980; 59: 357–62. pmid: 7431292
68. Тагава М., Матоба С., Нарита М., Сайто Н., Нагаи Т., Имаи К. Получение монозиготных телят-близнецов с использованием техники разделения бластомеров и системы культивирования «Well of the Well». Териогенология. 2008; 69: 574–82. pmid: 18242681
69. Катаяма М., Эллерсик М.Р., Робертс Р.М. Развитие монозиготных эмбрионов мышей-близнецов от момента разделения бластомеров на двухклеточной стадии до бластоцисты. Биол Репрод.2010; 82: 1237–47. pmid: 20181620
70. Папайоанну В.Э., Эберт К.М. Полуэмбрионы мыши: жизнеспособность и выделение клеток в бластоцисте. Dev Dyn. 1995; 203: 393–8. pmid: 7496031
71. Цунода Ю., Макларен А. Влияние различных процедур на жизнеспособность мышиных эмбрионов, содержащих половину нормального количества бластомеров. J Reprod Fertil. 1983; 69: 315–22. pmid: 6887141

границ | Т-клетки активно проникают в белое вещество мозга стареющей обезьяны в связи с повышенной реактивностью микроглии и снижением когнитивных функций

Введение

Даже при отсутствии патологической нейродегенерации нарушения в обучении, памяти, управляющих функциях и скорости обработки данных начинаются уже в третьем десятилетии (1), что делает снижение когнитивных функций отличительным признаком как здорового, так и нейродегенеративного старения мозга.Кроме того, существует большая индивидуальная вариабельность в степени тяжести и возрасте начала этих когнитивных изменений, при этом некоторые люди стареют очень успешно, но около 30% людей страдают тяжелыми когнитивными нарушениями, не отвечающими критериям болезни Альцгеймера или клинической деменции (2). ). Снижение когнитивных функций при нормальном старении не может быть связано с потерей нейронов, поскольку плотность нейронов остается стабильной на протяжении всей жизни (3). Вместо этого исследования с использованием МРТ и анализа тканей показали, что объем белого вещества уменьшается с возрастом и коррелирует с когнитивными нарушениями у здоровых пожилых людей (4–7).Примечательно, что повреждение трактов белого вещества не происходит одинаково по всему мозгу, поскольку визуализация тензора диффузии показала, что у стареющих людей разрушение происходит сначала и в большей степени в трактах лобного белого вещества, а также в поясной связке по сравнению с трактами. затылочной и височной долей (8–12).

Обезьяна-резус — широко используемая модель для изучения нормального старения, поскольку она демонстрирует снижение когнитивных функций в тех же областях, что и люди, и имеет схожие пропорции успешных и неуспешных возрастов (13).Обширное когнитивное тестирование на нашей обезьяньей модели нормального старения продемонстрировало возрастные нарушения в обучении, памяти и исполнительных функциях (14). Более того, у макак-резусов не развивается болезнь Альцгеймера или другие нейродегенеративные заболевания, и объем серого вещества и количество нейронов стабильны на протяжении всей жизни (14-17). Таким образом, макака-резус может служить моделью возрастного когнитивного нарушения нормального старения без замешательства оккультной невропатологии, которая бросает вызов исследованиям на людях.Важно отметить, что у макак-резусов соотношение белого и серого вещества аналогично человеческому, и наблюдается возрастное уменьшение объема белого вещества и увеличение повреждения миелина, что коррелирует со снижением когнитивных функций (17–19). Диффузионная визуализация у макак-резусов подтверждает такую же дифференциальную уязвимость трактов белого вещества, наблюдаемую у людей, при этом лобные тракты демонстрируют разрушение, в то время как другие тракты белого вещества, такие как внутренняя капсула, остаются стабильными с возрастом; и эти расстройства тракта коррелируют с когнитивными нарушениями (20).Ультраструктурное исследование мозга нашей обезьяны показало, что патология белого вещества начинается с расщепления оболочки и образования баллонов, заполненных дегенерирующей цитоплазмой или жидкостью (21, 22). Такие дефекты присутствуют в <1% ножен у молодых обезьян, но увеличиваются в 7 раз до 7-8% у самых старых обезьян и коррелируют с когнитивными нарушениями (19). Эти ультраструктурные исследования подтвердили уязвимость лобных трактов белого вещества к повреждению миелиновой оболочки (19, 21, 23).Кроме того, эта патология сопровождается дегенерацией аксонов, хотя и с меньшей частотой (0,1–0,8%) (19), так что вполне вероятно, что наблюдаемая патология миелина нарушает проводимость аксонов, вызывая разрыв связи, который, вероятно, способствует когнитивным нарушениям (18, 22). , 24).

Хотя точные причины патологии миелина при старении неизвестны, несколько различных процессов могут играть важную роль. Поддержание миелина или гомеостаз зависит от сложного взаимодействия созревания олигодендроцитов, пластичности миелина, удаления и очистки миелиновых остатков и ремиелинизации — процессов, на которые все негативно влияет старение (25–29).Неспособность клеток-предшественников олигодендроглии (OPC) созреть в миелинизирующие олигодендроциты приводит к снижению ремиелинизации в животной модели демиелинизации (30), а у старых грызунов снижается способность пополнять свою популяцию OPC, что может частично лежать в основе возрастной недостаточности миелина. ремонт (29). У стареющих людей количество олигодендроглий с возрастом уменьшается на 34%, в то время как нейроны, микроглия и астроциты остаются относительно стабильными на протяжении всей жизни (25). Микроглия играет критическую роль в стимулировании дифференцировки клеток-предшественников олигодендроцитов в зрелые миелинизирующие олигодендроциты (31), поскольку это созревание ингибируется присутствием миелиновых остатков в локальной нейросреде (32) — мусора, который обычно очищается микроглией.Таким образом, микроглия играет многогранную роль в стимулировании ремиелинизации олигодендроглии (33). С возрастом микроглия насыщается липофусцином, остатком фагоцитированного материала, который накапливается и может мешать способности клетки поглощать больше мусора (34). С возрастом микроглия становится менее эффективной в очищении миелина и становится хронически реактивной, на что указывает повышенная плотность амебоидной и гипертрофической микроглии в пожилом мозге, что коррелирует с серьезностью когнитивного снижения у старых обезьян (35).Наряду с неспособностью очистить миелиновый мусор, стареющая микроглия также характеризуется увеличением секреции провоспалительных цитокинов, которые, как известно, негативно влияют на когнитивные функции и увеличивают производство активных форм кислорода (АФК), которые могут непосредственно действовать, чтобы расщепить липиды миелиновая оболочка (36, 37). Вместе эти данные предполагают, что микроглия, основная клетка иммунной системы мозга, может способствовать возрастной патологии миелина и потере белого вещества.

В дополнение к их вероятной роли в усугублении повреждения миелина стареющие микроглии вносят вклад в более общее явление, известное как «воспаление»; термин, который использовался для описания хронического увеличения провоспалительных цитокинов и хемокинов в стареющей ЦНС (38, 39).Системное воспаление усиливается с возрастом и, как полагают, вызвано нарушением регуляции врожденной иммунной системы, в частности чрезмерной активацией моноцитов и секрецией провоспалительных молекул (40). Возрастное нейровоспаление было зарегистрировано у разных видов, от грызунов до людей, и было показано, что оно связано с нормальными когнитивными нарушениями, а также с возрастными нейродегенеративными заболеваниями (41–43). У стареющих грызунов повышенная секреция провоспалительных цитокинов сопровождается снижением когнитивных способностей, в то время как животные с большим количеством противовоспалительных цитокинов остаются более когнитивными (43).Было продемонстрировано, что провоспалительные цитокины лежат в основе снижения секреции нейротрофинов и ингибируют нейрогенез (44, 45). В нашей модели нормального старения и дегенерации белого вещества приматов мы показали, что микроглия существует в состоянии хронической активации и проявляет признаки повышенной фагоцитарной активности, состояния, которые коррелируют с тяжестью когнитивных нарушений (35). Хотя изменения микроглии, клеток врожденной иммунной системы, при старении мозга были охарактеризованы, меньше известно о том, как клетки адаптивной иммунной системы, такие как Т-клетки, могут участвовать в старении ЦНС.

Согласно общепринятому мнению относительно иммунных привилегий мозга, перекрестная связь между ЦНС и периферической иммунной системой в значительной степени ограничивается гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ) (если он не был поврежден болезнью или травмой), предотвращая иммунные клетки периферических органов. кровь от попадания в ЦНС. Повторное рассмотрение этих вопросов показало, что ЦНС-антиген-специфические Т-лимфоциты располагаются в пограничных зонах ЦНС, таких как мозговые оболочки и сосудистое сплетение, и оказывают различные эффекты на мозг, в том числе играют важную роль в нормальной когнитивной функции (46, 47).Таким образом, до недавнего времени считалось, что Т-клетки периферической иммунной системы пересекают здоровый ГЭБ только для исследования среды мозга на предмет инфекции, после чего они возвращаются в периферическое кровообращение через лимфодренаж мозга (48) . С возрастом Т-клетки в сосудистом сплетении претерпевают сдвиг от более гомеостатического профиля к более пагубному провоспалительному профилю, что отрицательно связано с познанием (49, 50). Более того, недавнее исследование также продемонстрировало наличие Т-клеток в паренхиме стареющего мозга, где они, как было показано, играют негативную роль в познании, подавляя нейрогенез в гиппокампе (51).

Чтобы определить, участвуют ли Т-клетки в старении белого вещества, мы исследовали когорту из 34 макак-резусов разного возраста и обоих полов, когнитивно охарактеризованных и демонстрирующих разную степень возрастных когнитивных нарушений (рис. 1В). Предыдущие исследования показали, что повреждение миелиновой оболочки, особенно во фронтальном белом веществе, было лучшим предиктором когнитивных нарушений, связанных с возрастом (19, 21, 23, 52). Активация микроглии и фагоцитарная дисфункция, особенно в стареющем белом веществе, коррелируют с тяжестью когнитивных нарушений и, как предполагается, играют центральную роль в возрастных нарушениях гомеостаза миелиновой оболочки (34, 35, 53–55).В настоящем исследовании мы специально спрашивали, сопровождается ли повреждение миелина и хроническая активация микроглии в лобном белом веществе наших стареющих обезьян периферическим иммунным ответом Т-клеток. Мы демонстрируем, что не только Т-клетки, окружающие кровеносные сосуды, увеличиваются с возрастом, но Т-клетки также проникают в паренхиму белого вещества, где они коррелируют со степенью реактивности микроглии и когнитивными нарушениями. Здесь мы представляем основу для изучения Т-лимфоцитов как нового игрока в нормальном возрастном когнитивном снижении.

Рисунок 1 . Субъекты и параметры эксперимента: (A) Таблица, в которой перечислены 34 макаки-резус, использованные в этих экспериментах, с указанием идентификатора животного, возраста, пола и оценки когнитивных нарушений; (B) Линейная регрессия возраста животных и индекса когнитивных нарушений (CII) у всех 34 обезьян, демонстрирующих возрастное ухудшение когнитивных функций; (C) Окрашенный тионином срез животного AM301, показывающий интересующие области, использованные в этих экспериментах, с поясной извилиной (красный), поясной связкой (желтый) и мозолистым телом (зеленый).AM, стареющая обезьяна; CII, индекс когнитивных нарушений.

Методы

Субъекты

Самцы и самки макак-резус в возрасте 5–30 лет, что соответствует возрасту человека 15–90 лет (56), были тщательно отобраны, чтобы исключить субъектов с сопутствующими заболеваниями или экспериментальными манипуляциями, которые могут затруднить исследования стареющего мозга и поведения (рис. 1А). Во время исследования субъекты содержались в Центре зоотехники в Медицинском кампусе Бостонского университета (BUMC), который полностью аккредитован AAALAC и управляется лицензированным ветеринаром.Все процедуры соответствовали Руководству NIH по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по использованию и уходу за животными (IACUC) BUMC.

Индекс поведенческого тестирования и когнитивных нарушений

Monkeys получили батарею поведенческих тестов для оценки обучаемости, памяти и исполнительных функций. Эта батарея состоит из отложенного несовпадения с образцом (DNMS), диапазона отложенного распознавания (DRST), объектных и пространственных модальностей, отложенного ответа и концептуальных задач смены набора.Эти задачи кратко описаны ниже, а более подробную информацию можно найти в (14, 57, 58), а также краткое изложение того, как рассчитывается наш индекс когнитивных нарушений на основе подмножества этих задач (13). Тестирование проводилось 5 дней в неделю и использовались пищевые награды. Вода доступна ad libitum , и ежедневный рацион, состоящий из еды, фруктов и овощей, предоставляется каждый день после завершения тестирования.

Задержка несоответствия с образцом (DNMS)

DNMS — это эталонная задача обучения и распознавания памяти, которая измеряет способность обезьяны различать недавно представленный знакомый объект и новый объект после периода задержки в 10 с.Как только это будет изучено, дополнительные тесты памяти распознавания будут выполнены после задержек в 2 минуты, а затем 10 минут. Выходные данные фазы сбора данных, фазы 2-минутной задержки и 10-минутной фазы задержки используются в качестве измерений для этой задачи обучения и распознавания памяти.

Объект Span Task (DRST) и пространственное распознавание

Это тестирует емкость рабочей памяти обезьяны, требуя, чтобы обезьяна идентифицировала новый стимул среди увеличивающегося набора последовательно предъявляемых, знакомых стимулов, сначала используя пространственные, а затем непространственные (объекты) стимулы.Выходные данные — это диапазон правильных ответов во время испытаний как мера рабочей памяти.

Тест отложенного ответа (DR)

Это тестирует пространственную рабочую память обезьян, оценивая способность обезьяны правильно определять после различных задержек местонахождение пищевой награды, которую они ранее видели скрытой.

Задача по смене концептуального набора

Это тестирует исполнительное функционирование обезьяны, заставляя обезьяну изучать правила, которые не были изучены явно. Как и в случае с задачей сортировки карточек в Висконсине, как только задача изучена, «правило» переключается, и обезьяна должна переключиться, чтобы изучить новое правило.Результат основан на ошибках, которые делает обезьяна, и, в частности, на персеверативных ошибках, сделанных после смещения установки, как мера исполнительной функции.

Расчет индекса когнитивных нарушений (CII)

Анализ основных компонентов показал, что оценки по DNMS-захвату, DNMS-2-минутной задержке и DRST-пространственному были лучшими предикторами когнитивных нарушений, связанных с возрастом. На основе этого подмножества оценок вычисляется средневзвешенное значение и преобразуется в оценку z , которая нормализуется к средней результативности когорты контрольной группы из 29 молодых здоровых обезьян-самцов.Это составляет индекс когнитивных нарушений (CII) для каждой обезьяны как представление об их общей способности к обучению и памяти. Таким образом, CII ( z -балл) <1,0 отражает отсутствие нарушений, 1,0–2,0 отражает легкое нарушение, а баллы выше 2,0 считаются тяжелыми когнитивными нарушениями (13). Распределение когнитивных нарушений у 34 макак-резусов, исследованных в этом исследовании, представлено на рисунке 1B.

Сбор и обработка тканей мозга

После завершения поведенческого тестирования мозг был взят для обработки тканей и молекулярных экспериментов.Подробное описание сбора, хранения и подготовки тканей можно найти в (59, 60). Вкратце, обезьян умерщвляли путем обескровливания во время двухэтапной транскардиальной перфузии мозга, которая начинается с буфера Кребса при 4 ° C для очистки сосудистой сети и охлаждения мозга для замедления протеолиза, позволяя при этом рассечение свежей ткани одного полушария для молекулярных экспериментов. По завершении сбора свежей ткани перфузат переключается на 4% параформальдегид (37 ° C), чтобы обеспечить полную фиксацию неповрежденного полушария.Затем мозг блокируют in situ в корональной стереотаксической плоскости и хранят в течение ночи в 4% параформальдегиде при 4 ° C. Фиксированную ткань головного мозга (включая полностью неповрежденное полушарие) затем удаляют из фиксатора, промывают, криозащищают в буфере с глицерином (61), мгновенно замораживают и хранят при -80 ° C до тех пор, пока не разрезают на 10 прерывистых серий срезов толщиной 30 мкм. интервалы между секциями в серии составляют 300 мкм. Вырезанные срезы хранили в буфере с 15% глицерином при -80 ° C до удаления в качестве группы для пакетной обработки, процесс, который не влияет на иммуногистохимию (59).

Иммуногистохимия

Для идентификации CD3 ⁺ Т-клеток были отобраны срезы тканей из всех соответствующих случаев, чтобы получить 6–9 срезов, каждый на расстоянии 2400 мкм друг от друга, для каждого животного для анализа пучка цингулюма, передней части тела и рострума мозолистого тела и поясной извилины. извилина (рис. 1С). Эти области были выбраны из-за их известного возрастного повреждения миелина у людей и нашей обезьяньей модели нормального старения (10, 19). Серое вещество поясной извилины было выбрано в качестве соседней контрольной области, не подверженной нормальному старению белого вещества.Ткань из всех ящиков была извлечена из морозильника, разморожена при комнатной температуре и обработана партиями в одних и тех же реагентах в одно и то же время, чтобы исключить вариативность обработки. Срезы промывали 0,05 М трис-буферным солевым раствором (TBS) при pH 7,6 для удаления глицерина. Чтобы разорвать поперечные связи, образованные во время фиксации, извлечение антигена затем выполняли путем инкубации ткани в буфере Трис-ЭДТА при pH 9 в микроволновом процессоре для ткани (PELCO Biowave, Ted Pella, Inc., Реддинг, Калифорния) в течение 10 минут при 40 ° C. и мощность 550 Вт с последующей инкубацией в том же буфере при комнатной температуре в течение 1 часа.Затем срезы промывали TBS (3 × 5 мин) и блокировали в течение 1 ч в SuperBlock (Life Technologies, Grand Island, NY) при комнатной температуре с последующей инкубацией в первичном антителе CD3 (BioRad, моноклональные крысиные анти-CD3, клон CD3- 12, MCA1477), разбавленный до 1: 500 в TBS с 0,5% SuperBlock и 0,3% Triton X-100 (Sigma) в течение 24 ч при комнатной температуре на качалке. Контрольные срезы инкубировали в том же растворе без первичного антитела. После инкубации ткань промывали TBS (3 × 5 мин) и гасили в 3% H ₂ O ₂ в течение 30 минут при комнатной температуре для инактивации эндогенных пероксидаз.Ткань снова промывали TBS (3 × 5 мин) и инкубировали в растворе вторичных антител в TBS, содержащем 0,5% Superblock, 0,3% Triton X и концентрацию биотинилированного козьего вторичного антитела против крысы в концентрации 1: 600 (Vector Laboratories, Burlingame, CA ) в течение 1 ч при комнатной температуре. Ткань промывали TBS (3 × 5 мин), а затем инкубировали в комплексе авидин-биотин с использованием набора Vectastain ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубации ткань промывали TBS (3 × 5 мин), а затем инкубировали в растворе хромогена, содержащем 0.5 мМ 3-3-диаминобензадин (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и 0,03% перекиси водорода в TBS в течение 10 мин. Затем срезы тканей подвергали заключительной промывке в TBS (3 × 5 мин) и хранили при 4 ° C до установки на предметные стекла, покрытые желатином, и сушили на воздухе в течение 48 часов перед обезвоживанием спиртами и очисткой ксилолами (2 × 20 мин. ). Слайды закрывали Permount (Fisher Scientific, Waltham, MA), располагали анатомически и закрывали для количественной оценки.

Окрашивание фибриногеном проводили на 3 срезах ткани, расположенных на расстоянии 7200 мкм друг от друга, на каждого субъекта из подгруппы когорты для анализа связки поясной извилины, передней части тела, рострума мозолистого тела и поясной извилины (рис. 1C).Использовался тот же протокол IHC, что и описанный выше, с первичным антителом (DAKO, поликлональное кроличье антифибриноген, A0080) в концентрации 1: 5000 и вторичным антителом (биотинилированное козье анти-кроличье антитело, Vector Laboratories, Burlingame, CA) в концентрация 1: 1000.

Чтобы идентифицировать микроглию LN3 ⁺, срезы тканей были отобраны из подгруппы тех же субъектов в возрасте старше 20 лет, чтобы получить 6–9 срезов, каждый на расстоянии 2400 мкм друг от друга, для каждого животного для анализа связки поясной извилины. переднее тело и головотрубка мозолистого тела и поясная извилина (рис. 1С).Для ИГХ срезы извлекали из морозильника и размораживали, как описано выше, и обрабатывали с помощью тех же этапов, что и для серии CD3, за исключением этапа первоначального извлечения антигена. Первичное антитело LN3 (Thermo Fisher, моноклональная мышь, анти-LN3, клон LN3, MA1-35420) использовали в концентрации 1: 100, а вторичное — в концентрации 1: 600 (биотинилированные антитела против мышиных Vector Laboratories, Burlingame , Калифорния). Цветное осаждение проводили с тем же раствором хромогена, описанным выше, с добавлением 0.1 М сульфат никеля.

Многометровую иммунофлуоресценцию выполняли, как описано выше, но с двухчасовой стадией блокирования, инкубацией в течение ночи с первичными антителами к CD3 (1: 500, BioRad, моноклональные крысиные анти-CD3, клон CD3-12, MCA1477), коллаген IV ( 1: 500, Sigma, моноклональные мышиные антитела против коллагена IV, клон COL-94, C1926) и GFAP (1: 1000, Dako, поликлональные кроличьи анти-GFAP, Z0334) с последующей 2-часовой инкубацией в соответствующей флуоресцентной метке. вторичные антитела. Ткань устанавливали на предметное стекло и отображали с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM 710 NLO при большом увеличении (40-кратный масляный объектив).

Количественное определение Т-клеток и микроглии

Беспристрастная стереология была выполнена на световом микроскопе Nikon E600, оснащенном цифровой камерой Q-Imaging, моторизованным столиком и программным обеспечением StereoInvestigator (MBF Bioscience, Williston, VT). Интересующие области (поясная связка, мозолистое тело и поясная извилина) были идентифицированы и разграничены (рис. 1C) при малом увеличении (объектив 1X). Метод оптического фракционирования, описанный ранее (62) и примененный к ткани обезьяны (60), был использован для количественного определения CD3- и LN3-положительных клеток в каждой из этих областей интереса при большом увеличении (объектив 20X).Вкратце, сетка выборки была размещена с рандомизированным начальным местоположением по каждой выделенной области интереса. Внутри каждого квадрата сетки отбора проб помещали счетную рамку с верхним защитным объемом диссектора, простирающимся на 2 мкм ниже поверхности среза ткани. Подсчитывали клетки, не пересекающие плоскости исключения. Размер сетки и процент подсчета были оптимизированы, чтобы минимизировать коэффициент ошибки (CE), который рассчитывается, как сообщалось ранее (63). Значения CE были ≤ 0,10 для всех областей интереса, кроме серого вещества поясной извилины и для других областей интереса у молодых животных.В этих случаях значения CE ниже 0,1 были недостижимы из-за низкого общего количества подсчитываемых Т-клеток. Оценщик Cavalieri использовался для расчета объема каждой рентабельности инвестиций. При подсчете CD3 ⁺ Т-клетки были классифицированы как «паренхиматозные», если они не граничили с кровеносным сосудом. «Периваскулярные» Т-клетки были классифицированы как клетки, окружающие сосуд (Рисунки 2A – C). Микроглии LN3 ⁺ были идентифицированы как разветвленные, гипертрофические или амебоидные на основании их морфологии, как описано ранее (64).

Рисунок 2 . Т-клетки инфильтрируют паренхиму белого вещества при старении: (A) CD3 ⁺ Окрашивание IHC (коричневый) в белом веществе молодых и старых обезьян (B) , иллюстрирующее увеличение плотности паренхиматозных Т-клеток у старый мозг. На вставках показан увеличенный вид; (C) Флуоресцентное мульти-мечение, чтобы показать, что периваскулярные Т-клетки (CD3 ⁺ в зеленом цвете) находятся в глимфатическом пространстве между базальной мембраной (коллаген IV желтым цветом) и концами астроцитов (GFAP красным цветом). (D, E) как периваскулярные, так и паренхимные Т-клетки значительно увеличиваются в связке цингулюма с возрастом; (F, G) Периваскулярные и паренхимные Т-клетки значительно увеличиваются в мозолистом теле с возрастом; (H, I) Т-клетки не увеличиваются в сером веществе поясной извилины с возрастом. CB, поясная связка; CC, мозолистое тело; CG, поясная извилина. N = 34.

Количественное определение фибриногена

Та же самая установка микроскопа, описанная выше, использовалась, чтобы сначала очертить интересующие области (поясная связка, мозолистое тело и поясная извилина) при малом увеличении (объектив 1x).Поверх каждой области интереса была размещена сетка, чтобы можно было выполнять систематический случайный отбор образцов для получения изображений для анализа окрашивания фибриногена. Изображение было получено при большом увеличении (линза объектива 20X) на каждом 6-м участке сетки для связки поясной извилины, на каждом 8-м для мозолистого тела и на каждом 15-м участке для поясной извилины. Программное обеспечение Image J (NIH) использовалось для преобразования изображений в 32-битные и автоматически устанавливались пороговые значения (настройка «По умолчанию»), чтобы затем вычислить процент окрашенной площади. Измерения в одной и той же области одного и того же животного были усреднены, чтобы получить единственное значение, представляющее средний процент окрашенной области на область для каждого субъекта.

Статистика

Все переменные, включая возраст, обрабатываются как непрерывные числовые значения. Все регрессионные анализы проводились по независимым измерениям с использованием Prism со значением альфа-значимости 0,05.

Результаты

Т-клетки проникают в паренхиму белого вещества старого мозга

Мы использовали анти-CD3 для маркировки всех подтипов Т-клеток в ЦНС. Первоначальное наблюдение срезов ткани, окрашенных антителом к CD3, выявило ожидаемое присутствие CD3-положительных Т-клеток в сосудистом сплетении, эпендиме, выстилающей желудочки, и мозговых оболочках, как сообщалось ранее (49, 65, 66).Однако было также отмечено, что Т-клетки присутствовали вокруг проникающей сосудистой сети, а также в паренхиме белого вещества, прежде всего в пожилом мозге (Рисунки 2A, B). Мы обозначили эти популяции как периваскулярные и паренхиматозные соответственно.

Чтобы подтвердить пространственную связь периваскулярных Т-клеток с сосудистой сетью, мы провели иммунофлуоресценцию с несколькими метками с использованием антител против CD3 (Т-лимфоцитов), коллагена IV (базальная мембрана эндотелия) и GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок — для маркировки кончиков астроцитов). вокруг кровеносных сосудов) и обнаружили, что эти периваскулярные Т-клетки расположены в «глимфатическом пространстве» (67), проксимальнее отложения астроцитов, но за пределами базальной мембраны, так что они ограничены от прямого контакта с паренхимой мозга (рис. 2С).Напротив, паренхиматозные Т-клетки не были связаны с какими-либо сосудистыми элементами, а вместо этого были расположены в ткани мозга. Количественная оценка определила их как уникальные из-за их локализации в белом веществе.

Ткань, окрашенная на CD3, у 34 макак-резусов (16 самцов и 18 самок) в возрасте от 5 до 30 лет (см. Рис. 1A) была проанализирована для количественного определения плотности паренхиматозных и периваскулярных Т-клеток в трех представляющих интерес областях — белом веществе пучка поясной извилины. и мозолистое тело, и серое вещество поясной извилины.Как показано на рисунках 2D – G, плотность периваскулярных Т-клеток значительно увеличивается с возрастом в связке поясной извилины [ F _{(1, 32)} = 5,203, R ² = 0,1399, p ≤ 0,05] и мозолистое тело [ F _{(1, 32)} = 4,79, R ² = 0,1302, p ≤ 0,05]. Плотность паренхиматозных Т-клеток также значительно увеличивается с возрастом в связке поясной извилины [ F _{(1, 32)} = 11,10, R ² = 0.2575, p ≤ 0,05] и мозолистое тело [ F _{(1, 32)} = 10,88, R ² = 0,2537, p ≤ 0,05]. В сером веществе прилегающей поясной извилины Т-клетки были редки как в периваскулярном, так и в паренхиматозном отделах, и ни один из них не показал значительных различий с возрастом [периваскулярный F _{(1, 32)} = 2,092, R ² = 0,06136, p = 0,1578 и паренхиматозно F _{(1, 32)} = 1.815, R ² = 0,05368, p = 0,1874] (Рисунки 2H, I).

Процент Т-клеток ЦНС в паренхиме увеличивается с возрастом

Наблюдаемые здесь периваскулярные Т-клетки могут представлять собой клетки, которые либо входят в паренхиму, либо выходят из нее (68), либо ведут себя как резидентные регуляторы пограничной зоны, которые выполняют различные функции посредством передачи сигналов цитокинов (46, 66). По этой причине мы сравнили процентное содержание Т-клеток в паренхиме (паренхиматозно / (паренхиматозно + периваскулярное)) с процентом Т-клеток в периваскулярном пространстве в зависимости от возраста в пучке цингулюма и мозолистом теле (рисунки 3A, B).Как показано на рисунках 3C, D, мы обнаружили, что в связке поясной извилины процент Т-клеток в периваскулярном пространстве был снижен, в то время как наблюдалось дополнительное увеличение процента Т-клеток в паренхиме [ F _{(1, 32). )} = 9,86, R ² = 0,236, p ≤ 0,05]. Это предполагает усиленное накопление паренхимы, что может быть связано с увеличением проникновения, уменьшением выхода или сочетанием того и другого. Напротив, как показано на рисунках 3E, F, в мозолистом теле не было значительного сдвига с возрастом в процентном содержании Т-клеток в периваскулярном пространстве по сравнению с паренхимой [ F _{(1, 32)} = 1.11, R ² = 0,0336, p = 0,2991].

Рисунок 3 . Большая доля Т-клеток в паренхиме белого вещества с возрастом: (A, B) Репрезентативные изображения интересующей области для окрашенных CD3 ⁺ Т-клеток у молодой (A) и старой (B) обезьяны. На вставке показаны детали, расположение вставки отмечено * на большом изображении. Шкала 100 мкм. (C, D) Процент периваскулярных Т-клеток уменьшается, в то время как процентное содержание в паренхиме увеличивается с возрастом в связке поясной извилины; (E, F) Процент периваскулярных Т-клеток, а также клеток в паренхиме не изменяется с возрастом в мозолистом теле.CB, поясная связка; CC, мозолистое тело. N = 34.

Проникновение Т-лимфоцитов в связку цингулюма коррелирует с реактивностью микроглии

Мы оценили, просачиваются ли Т-клетки в паренхиму головного мозга через поврежденный гематоэнцефалический барьер, выполнив иммуногистохимию для количественного определения фибриногена в паренхиме головного мозга. Фибриноген — это большой (340 кДа) белок коагуляции, обнаруженный в сыворотке крови, который не должен присутствовать в мозге, если ГЭБ не поврежден, что позволяет использовать иммуногистохимическое окрашивание и количественную оценку фибриногена в мозге для оценки утечки ГЭБ для молекул меньше 340 кДа. (69).Окрашивание фибриногеном в подгруппе из 15 обезьян (8 самцов и 7 самок) в возрасте 6,5–29,6 лет определялось количественно как процент площади, окрашенной в пучке цингулюма, мозолистом теле и поясной извилине. В сером веществе поясной извилины окрашивание почти исключительно связано с сосудистой сетью. Окрашивание белого вещества немного варьировалось между субъектами и варьировалось от преимущественно сосудистого, связанного с некоторым глиальным окрашиванием фибриногена, поскольку он связывается с рецепторами CD11b (70–72) (рис. 4A, B). Как показано на рисунках 4C – E, процентная площадь окрашивания фибриногена в паренхиме головного мозга была минимальной и варьировалась от 0.05 до 1,7% по всем областям интереса и случаям, что подтверждает предыдущие отчеты в исследовании окрашивания фибриногена мозга при БА у здоровых людей соответствующего возраста, что отражает целостность ГЭБ (73). Важно отметить, что окраска не изменялась с возрастом в связке поясной извилины [ F _{(1, 13)} = 0,00178, R ² = 0,000137, p = 0,9670], мозолистого тела [ F _{( 1, 13)} = 0,531, R ² = 0,0392, p = 0,4791], или поясная извилина [ F _{(1, 13)} = 0.000166, R ² = 1,28e-005, p = 0,9899]. Поскольку Т-клетки намного крупнее (5-7 мкм), чем фибриноген (340 кДа), маловероятно, что возрастная инфильтрация Т-клеток была вызвана разрушением ГЭБ. Тем не менее, чтобы проверить, могут ли Т-клетки быть связаны с таким низким уровнем фибриногена, мы исследовали взаимосвязь уровней фибриногена с плотностью периваскулярных и паренхиматозных Т-клеток. Как показано на фиг. 5A – D, не было никакой корреляции между инфильтрацией Т-клеток и количеством фибриногена в пучке поясной извилины [периваскулярный F _{(1, 13)} = 0.0409, R ² = 0,00313, p = 0,8429 паренхиматозно F _{(1, 13)} = 0,0643, R ² = 0,00492, p = 0,8038] или мозолистое тело [ периваскулярный F _{(1, 13)} = 0,222, R ² = 0,0168, p = 0,6454, паренхиматозный F _{(1, 13)} = 1,44, R ² = 0,0999, p = 0,2512], что позволяет предположить, что инфильтрация Т-клеток не происходит через протекающий ГЭБ у этих обезьян.

Рисунок 4 . Окрашивание фибриногена с возрастом: ИГХ для фибриногена использовали для оценки возможной утечки из сосудистой сети в репрезентативной подгруппе ( n = 15) обезьян (A, B) Репрезентативные изображения для демонстрации вариабельности окрашивания фибриногена между субъектами. На вставках показаны детали окрашивания сосудов и глии, которые были количественно определены как положительный сигнал. Расположение вставки отмечено * на большом изображении. Шкала 100 мкм. (C – E) Отсутствует значимое возрастное окрашивание фибриногена, поскольку процентное содержание его в поясной извилине (C) , мозолистом теле (D) и сером веществе поясной извилины ( Д) .CB, поясная связка; CC, мозолистое тело; CG, поясная извилина.

Рисунок 5 . Неплотность ГЭБ не учитывает инфильтрацию Т-лимфоцитов в белое вещество: (A – D) Присутствие фибриногена, измеренное по процентному окрашиванию площади, не коррелировало с плотностью периваскулярных или паренхиматозных Т-клеток в пучке цингулюма или мозолистом теле. CB, поясная связка; CC, мозолистое тело. N = 15.

Затем мы исследовали, может ли проникновение Т-клеток в мозг быть ответом на увеличение реактивности микроглии.Чтобы оценить, может ли наблюдаемое возрастное увеличение реактивности микроглии у самых старых субъектов этой когорты (≥20 лет, n = 13) быть связано с инфильтрацией Т-лимфоцитов, мы окрашивали ткань того же расстояния между срезами, что и CD3, с помощью антитело LN3 (рецептор против MHC-II) (Фигуры 6A, B). Нам было особенно интересно узнать о микроглии, которая участвует в презентации антигена через рецепторов MHC-II, которые, как предполагается, стимулируют и активируют Т-клетки ЦНС (74).Как описано Karperien et al. (64) мы классифицировали LN3-положительные подтипы микроглии по их морфологии как разветвленные, гипертрофические или амебоидные микроглии, отражающие от наименьшего до большинства воспалительных / фагоцитарных фенотипов (рис. 6С). Количественно оценивая микроглию с помощью этой классификационной схемы, мы обнаружили возрастное увеличение плотности поясного пучка, которое приблизилось к значимости для обоих амебоидов [ F _{(1, 11)} = 3,36, R ² = 0,234, p = 0.0941] и гипертрофической [ F _{(1, 11)} = 2,63, R ² = 0,193, p = 0,1330] микроглии (Фигуры 6D, E). С возрастом наблюдалось значительное снижение плотности разветвленной микроглии [ F _{(1, 11)} = 5,27, R ² = 0,324, p ≤ 0,05] (Рисунок 6F). Эти результаты согласуются с предыдущими выводами нашей модели о том, что амебоидная микроглия LN3 ⁺ увеличивается с возрастом в пучке цингулюма (35).Затем мы исследовали, связана ли эта повышенная реактивность микроглии с инфильтрацией Т-лимфоцитов, и обнаружили, что увеличение плотности амебоидных микроглии значительно коррелирует с более высокой плотностью паренхиматозных Т-клеток [ F _{(1, 11)} = 16.2, R ² = 0,595, p ≤ 0,05] (рисунок 6G). Не было связи между гипертрофическими [ F _{(1, 11)} = 0,224, R ² = 0,0199, p = 0.6455) или разветвленной [ F _{(1, 11)} = 1,58, R ² = 0,126, p = 0,2346) плотности микроглии и плотности Т-клеток (Рисунки 6H, I). Эти данные предполагают, что инфильтрация Т-лимфоцитов связана с усилением нейровоспаления, что количественно определяется плотностью провоспалительной микроглии.

Рисунок 6 . Реактивность микроглии коррелирует с инфильтрацией Т-клеток в пучке поясной извилины: (A, B) Типичные изображения интересующей области, отображающие более низкие (A), и более высокие уровни (B) реактивности микроглии при окрашивании LN3. (C) Реактивность микроглии в связке поясной извилины количественно оценивали путем подсчета плотности окрашенных LN3 ⁺ клеток по морфологии, группируя их на разветвленные (зеленый контур), гипертрофические (желтый контур) и амебоидные (красный контур). Плотность амебоидной микроглии (D) и гипертрофической микроглии (E) не изменялась с возрастом, однако наблюдалось значительное снижение плотности разветвленной микроглии с возрастом (F) . Плотность амебоидной микроглии коррелировала с плотностью Т-клеток, которые инфильтрировали паренхиму пучка цингулюма (G) .Плотность Т-клеток не коррелировала с плотностью гипертрофической (H) или разветвленной (I) микроглии. CB, поясная связка. N = 13.

Более высокий процент паренхиматозных Т-клеток коррелирует с когнитивными нарушениями

Мы сравнили наши данные о плотности Т-клеток с когнитивными оценками, установленными для каждого субъекта, как описано ранее (рис. 1B). Как показано на фиг. 7A, B, не было значительной взаимосвязи между абсолютной плотностью паренхиматозных Т-клеток и CII в связке поясной извилины [ F _{(1, 32)} = 2.02, R ² = 0,0595, p = 0,1646] или в мозолистом теле [ F _{(1, 32)} = 1,63, R ² = 0,0484, p = 0,2113 ]. Напротив, когда накопление Т-лимфоцитов в паренхиме оценивалось по процентному содержанию паренхимальных Т-клеток, как описано выше — паренхиматозные / (паренхиматозные + периваскулярные), — наблюдалась значительная взаимосвязь между процентом Т-клеток в паренхиме пучка цингулюма и когнитивными нарушениями. (CII) [ F _{(1, 32)} = 4.86, R ² = 0,132, p ≤ 0,05], но не в мозолистом теле [ F _{(1, 32)} = 0,0132, R ² = 0,000413, p = 0,9092] (Фигуры 7C, D). Это согласуется с предыдущими исследованиями, показавшими, что ни повреждение белого вещества, ни нейровоспаление в мозолистом теле не являются предикторами возрастного когнитивного снижения у макак-резусов, даже если эти изменения в поясном пучке (19, 35).

Рисунок 7 .Повышенный процент паренхиматозных Т-клеток в связке поясной извилины коррелирует с ухудшением когнитивных функций: плотность паренхиматозных Т-клеток не коррелирует с когнитивными нарушениями в связке цингулюма (A) или мозолистом теле (B) ; процент Т-клеток в паренхиме коррелирует с индексом когнитивных нарушений в поясном пучке (C) , но не в мозолистом теле (D) . CB, поясная связка; CC, мозолистое тело; CII, индекс когнитивных нарушений. N = 34.

Обсуждение

Сводка результатов

Старение приматов и человека характеризуется различной степенью когнитивного снижения, вызванного накоплением поврежденных миелиновых оболочек, а не дегенерацией нейронов, как это наблюдается при БА (3-7, 19, 75). Патология миелиновой оболочки ранее была охарактеризована в лобном белом веществе нашей модели нормального когнитивного старения приматов (19, 23, 76, 77). Более тщательное изучение этих областей выявило роль активированной дистрофической микроглии, которая коррелировала с тяжестью когнитивных нарушений (35).Здесь мы собираемся изучить, могут ли Т-клетки реагировать на усиление нейровоспаления и повреждения миелина в областях мозга, которые, как известно, уязвимы для возрастной патологии миелина у нормальных стареющих макак-резусов. Основные результаты этого исследования: (1) При нормальном старении Т-клетки, которые обычно исключаются из мозга у здоровых молодых людей, увеличиваются в периваскулярном пространстве, окружающем кортикальные кровеносные сосуды, и проникают в паренхиму белого вещества, но не проникают в него. серое вещество. (2) В белом веществе пучка поясной извилины, но не в прилегающем мозолистом теле, процент Т-клеток ЦНС, которые инфильтрируются и накапливаются в паренхиме белого вещества, увеличивается с возрастом по сравнению с таковыми в периваскулярном пространстве.(3) Т-клетки не пассивно «просачиваются» в мозг через поврежденный ГЭБ, а вместо этого инфильтрируются способом, который коррелирует с провоспалительной микроглией, классифицируемой как амебоидная (фагоцитарная), что свидетельствует об активном процессе. (4) Что наиболее важно, процент паренхиматозных Т-клеток в связке поясной извилины коррелирует с возрастными нарушениями когнитивной функции. Эти данные предполагают, что Т-клетки в белом веществе могут напрямую способствовать возрастному повреждению белого вещества и снижению когнитивных функций в здоровом, пожилом мозге.Следовательно, Т-клетки, проникающие в паренхиму ЦНС, могут способствовать повреждению белого вещества, что делает их мишенью для будущих терапевтических вмешательств, направленных на улучшение когнитивного старения.

Когнитивные нарушения и нейровоспаление при нормальном старении

Снижение когнитивных функций при нормальном, не нейродегенеративном старении происходит у обезьян (23) и людей (3, 7). Тщательные исследования, исключающие случаи болезни Альцгеймера на ранней стадии, показывают, что эти возрастные когнитивные нарушения не являются результатом дегенерации или потери корковых нейронов, а, вероятно, являются результатом, по крайней мере частично, возрастного накопления повреждения миелиновой оболочки с последующим последующим повреждением миелиновой оболочки. демиелинизация и потеря аксонов, приводящие к «разъединению» коры (19, 21, 24).Процессы, приводящие к повреждению миелина и неспособности восстановления миелиновой оболочки при нормальном старении, до конца не изучены, но было высказано предположение, что окислительное повреждение и воспаление способствуют повреждению липидов миелина и старению олигодендроцитов (78–80). У нормально стареющих обезьян возрастное увеличение количества миелиновых остатков может перегрузить фагоцитарную способность микроглии, что приведет к фагоцитарной неэффективности и накоплению интерстициальных миелиновых остатков. Это, в свою очередь, может нарушать созревание клеток-предшественников олигодендроцитов в зрелые миелинизирующие олигодендроциты, снижая их способность восстанавливать возрастные повреждения миелиновой оболочки (26–28, 31, 32, 34, 81).Более того, существует множество данных, демонстрирующих генерализованное возрастное увеличение маркеров воспаления как на периферии, так и внутри ЦНС, часто называемое «воспалением» (82, 83).

Известно, что нейровоспаление способствует развитию многих возрастных нейродегенеративных заболеваний, а также нормальному возрастному повреждению белого вещества (34, 82). Плотность LN3-позитивной активированной и Gal-3-позитивной фагоцитарной микроглии увеличивается с возрастом, в частности, в лобных трактах белого вещества и коррелирует с когнитивными нарушениями (19, 35).Кроме того, в стареющем мозге микроглия оказывается хронически провоспалительной с повышенной экспрессией IL-1β, IL-6 и TNF-α и сниженной экспрессией противовоспалительных цитокинов, таких как IL-10 (36). На периферии секреция провоспалительных цитокинов макрофагами может приводить к привлечению и активации Т-клеток (84). Здесь мы подтвердили возрастное увеличение провоспалительного фенотипа микроглии в белом веществе и дополнительно продемонстрировали положительную взаимосвязь между возрастным увеличением воспалительной микроглии и повышенной плотностью Т-клеток в паренхиме белого вещества.

Было обнаружено, что помимо очистки путем фагоцитоза микроглии, миелиновые остатки выводятся из головного мозга с помощью спинномозговой жидкости, откуда они могут стекать через лимфатические сосуды в глубокие шейные лимфатические узлы (67, 85, 86). Как только миелиновый мусор попадает в периферическое кровообращение, он может взаимодействовать с антигенпрезентирующими клетками (APC) в лимфатических узлах. Этот процесс наблюдался при многих демиелинизирующих заболеваниях и на соответствующих животных моделях (87). Следует отметить, что миелин-реактивные Т-клетки наблюдались на периферии здоровых людей, у которых отсутствовала грубая патология миелина (85).С возрастом основной белок миелина увеличивается в спинномозговой жидкости наших старых обезьян (неопубликованные данные), что может способствовать увеличению воздействия антигена на адаптивную иммунную систему и может объяснить, почему Т-клетки могут стать реактивными на миелин и перемещаться в определенные области белого вещества в стареющем мозге. , хотя это еще предстоит подтвердить на наших стареющих обезьянах.

Перенос Т-клеток в ЦНС

При болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваниях происходит нарушение целостности гематоэнцефалического барьера, что может, по крайней мере частично, объяснять инфильтрацию Т-лимфоцитов в человеческий мозг (73, 88–90).Здесь мы показываем, что в нормальном стареющем мозге обезьяны минимальная экстравазация фибриногена, которую мы наблюдаем, не связана с Т-клетками. Следовательно, инфильтрация Т-клеток в мозг при нормальном старении, вероятно, является активным и регулируемым процессом, а не результатом утечки через поврежденный ГЭБ.

Транспортировка Т-клеток из сосудистой сети в воспаленные ткани на периферии зависит от процесса, называемого «диапедез», который включает ступенчатую экспрессию рецепторов и лигандов на эндотелиальных клетках (т.е.g., E- и P-селектины) и Т-клетки (например, LFA-1) для облегчения замедления, скатывания, адгезии и миграции Т-клеток через эндотелий. Замедление и вращение опосредуются эндотелиальной экспрессией селектинов (E- и P-селектинов), за которой следует экспрессия их интегринов (ICAM и VCAM) (87, 91). Механизмы проникновения Т-клеток в паренхиму ЦНС обсуждаются, поскольку, по-видимому, не следует той же последовательности шагов, которая наблюдается в периферических тканях, и, таким образом, может служить для защиты иммунного привилегированного статуса мозга (68).Одним из примеров того, как ЦНС защищает свой иммунный статус, является то, что астроциты секретируют факторы, которые подавляют экспрессию E- и P-селектина на эндотелии BBB (92). Интересно, что на мышиных моделях РС (т.е. EAE) было показано, что проникновение Т-клеток в ЦНС не зависит от E- и P-селектинов, как у людей, а вместо этого, по-видимому, полагается исключительно на экспрессию ICAM и VCAM. на эндотелиальных клетках (92). Напротив, в невоспаленной ЦНС проникновение Т-клеток через ГЭБ мыши, по-видимому, зависит от Е- и Р-селектинов, а от , а не от ICAM или VCAM (93).Таким образом, эти различия между видами затрудняют конкретное изучение того, как Т-клетки проникают в ЦНС при здоровье и болезни.

Что касается невоспаленной ЦНС, большинство исследований согласны с тем, что Т-клетки могут проникать в ЦСЖ через интактный ГЭБ через сосудистого сплетения и / или лептоменингеальных кровеносных сосудов для наблюдения (66, 87, 94). Тем не менее, другие исследования показали, что миграция может происходить через проникающие паренхиматозные сосуды (95). Чтобы еще больше усложнить историю, исследования показали, что E- и P-селектины не экспрессируются эндотелием проникающих сосудов в человеческом мозгу, скорее это исключительно эндотелий менингеальных кровеносных сосудов и сосудов сосудистого сплетения ( 96).Следовательно, невозможно сделать твердые выводы относительно направленности (входа или выхода) периваскулярных Т-клеток, окружающих проникающие паренхиматозные сосуды в головном мозге стареющих обезьян. Однако мы показали увеличение процента Т-клеток в паренхиме, что может указывать на увеличение входа, уменьшение выхода или их комбинацию. Тем не менее, поскольку это накопление паренхимных Т-клеток коррелирует с ухудшением когнитивных функций, важно получить более полное представление о механизмах транспортировки, поскольку это может обеспечить возможности для снижения плотности паренхиматозных Т-клеток ЦНС и оказаться полезным для связанного с возрастом когнитивного снижения.

Т-клетки в пораженной ЦНС

Т-клетки, расположенные в сосудистом сплетении, способны наблюдать за спинномозговой жидкости и могут пересекать ГЭБ при распознавании антигена в случаях повреждения или заболевания (66, 97). После черепно-мозговой травмы микроглия сначала привлекает врожденную иммунную систему, а затем клетки адаптивной иммунной системы, включая Т-клетки, в пораженную область, где они участвуют в местном иммунном ответе ЦНС, направленном на нейровосстановление (98). Используя модель повреждения зрительного нерва у грызунов, исследователи продемонстрировали, что Т-клетки, специфичные для ЦНС (например,g., распознавание миелина) снижает потерю нейронов (99). Т-клетки, распознающие ЦНС-антиген, часто считались в значительной степени вредными из-за их роли в аутоиммунных заболеваниях, таких как рассеянный склероз (100). Однако более полезная роль аутореактивных клеток ЦНС была названа «защитным аутоиммунитетом», который защищает нейроны от вторичной дегенерации, которая, как известно, происходит после первоначального повреждения (101). Эта защитная роль зависит от популяции антиген-специфических Т-клеток ЦНС, которые находятся в мозговых оболочках и сосудистом сплетении и настроены реагировать на повреждение после травмы и способствуют полезному нейровоспалению и привлечению лимфоцитов для нейропротекции и восстановления (66, 88).

При болезни Альцгеймера нейровоспалительные процессы изучались преимущественно путем изучения реактивных астроцитов и микроглии (102–104). Хотя ранние сообщения предполагали присутствие Т-лимфоцитов в головном мозге больных пациентов (105, 106), их роль в БА была изучена только недавно. Было показано, что бляшки AD окружены активированной микроглией, которая, вероятно, взаимодействует с лимфоцитами CD8 ⁺ и может играть роль в патологии бляшек (107). Кроме того, эти AD-ассоциированные Т-клетки CD8 ⁺ могут вносить вклад в дисфункцию синаптической пластичности, и предотвращение их инфильтрации приводит к благоприятному восстановлению программ экспрессии генов нейральной пластичности (108).Характеристика Т-клеток, циркулирующих в спинномозговой жидкости пациентов с БА, выявила клональную экспансию эффекторных Т-клеток CD8 ⁺ с потенциальными последствиями для нейродегенерации через их цитотоксических эффекторных функций (109). Наши данные подтверждают эти данные о возрастной инфильтрации Т-клеток, но мы дополнительно характеризуем их инфильтрацию конкретно в области белого вещества с известной патологией миелина и коррелируем этот приток Т-клеток с нормальным когнитивным снижением.

Большая часть нашего понимания взаимодействия Т-клеток с миелином происходит из исследований рассеянного склероза человека и соответствующих животных моделей.Эти исследования показали, что воздействие эпитопов миелина на периферические Т-клетки может приводить к аутоатаке и демиелинизации, поскольку Т-клетки, изначально сенсибилизированные на периферии, реактивируются при входе в ЦНС (110–112). Исследования терапевтических средств, направленных на предотвращение проникновения Т-клеток в ЦНС, выявили ранее недооцененную роль надзора за вирусами с помощью Т-клеток и показали, что блокада Т-клеток потенциально смертельна (113). В случае вирусной инфекции, такой как вирус JC, Т-клетки, специфичные для вируса, способны обнаруживать наличие инфекции посредством иммунного надзора за спинномозговой жидкости и вызывать иммунный ответ для предотвращения прогрессирования смертельной демиелинизирующей болезни Прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалопатия ( PML) [обзор e.г., (114)]. Во время наблюдения за здоровым мозгом Т-клетки подавляют экспрессию цитолитических гранзимов и провоспалительных цитокинов, предотвращая аутоиммунную демиелинизацию (66, 115, 116). Было высказано предположение, что возрастное обострение нейровоспаления может нарушить эти нормальные гомеостатические функции иммунитета и иммунного надзора (82).

Т-клетки в здоровой ЦНС

Недавно было сообщено, что Т-клетки полезны для познания, включая обучение и память (46, 117).У мышей с иммунодефицитом, с истощенными Т-клетками, наблюдается нарушение обучения и памяти, которые можно спасти, восстановив нормальный функционирующий репертуар Т-клеток (118). Считается, что эти эффекты опосредуются CD4 ⁺ Т-клетками, которые секретируют IL-4, который побуждает астроциты секретировать BDNF (119). Было показано, что миелин-реактивные Т-клетки играют роль в нейрогенезе гиппокампа и поддерживают пространственное обучение (117). Однако возрастные сдвиги в иммунной системе, известные как «воспаление», заставляют хориоидальные Т-клетки сдвигаться в сторону провоспалительного профиля, что может быть вредным для познания (49).Кроме того, сообщалось, что инфильтрация Т-клеток в височную долю старых мышей ингибирует нейрогенез гиппокампа и приводит к нарушению пространственного обучения и памяти (51). Недавние исследования БА у человека показали приток Т-клеток CD8 ⁺ в контрольный мозг соответствующего возраста, но не охарактеризовали подробно белое вещество на протяжении всей жизни, что мы и сделали здесь (108).

Наше текущее исследование не изучает гиппокамп или сосудистое сплетение, а вместо этого сосредоточено на областях белого вещества, которые ранее были связаны как с патологией миелина, так и со снижением когнитивных функций, наблюдаемым у нормальных стареющих обезьян (19) и людей (75).Мы, в частности, были заинтересованы в том, чтобы продолжить наши предыдущие выводы о том, что повреждение белого вещества и дисфункция микроглии в поясной связке макаки-резуса были связаны с возрастными когнитивными нарушениями (19, 35), но теперь добавляем наблюдение, что инфильтрация Т-клеток коррелирует с региональное нейровоспаление (активированная микроглия), а также снижение когнитивных функций.

Очень мало исследований систематически исследуют белое вещество при нормальном старении, поэтому мало что известно о функции проникающих в паренхиму Т-клеток.Исследования старения белого вещества на грызунах часто неадекватны для характеристики мозга на достаточно позднем этапе старения, чтобы обнаружить изменения белого вещества, которые мы наблюдаем у людей и приматов (66, 120). Hill et al. обнаружили, что повреждение миелина сравнимо с обезьянами и людьми только у очень старых мышей> 600 дней или 20 месяцев (120). В нескольких отчетах, посвященных исследованию нормального стареющего мозга мышей, сообщается о возрастном увеличении Т-клеток, но многие сообщают, что они в основном периваскулярные, менингеальные или хориоидальные (66, 121).Ритцель и его коллеги изучали мышей в возрасте до 22 месяцев и сообщили, что эти ассоциированные с возрастом Т-клетки способствуют подавлению реактивности микроглии и поощряют наблюдение (66). Вместо этого мы предполагаем, что Т-клетки, которые активно инфильтрируют стареющую паренхиму белого вещества, могут быть миелин-реактивными и могут играть пагубную роль в разрешении или, возможно, обострении возрастного повреждения миелина и связанного с ним когнитивного снижения. Хотя мы подтвердили возрастное увеличение периваскулярных Т-клеток, которое действительно может быть регуляторным, мы добавляем, что у стареющих приматов, особенно у тех, которые демонстрируют наиболее серьезное снижение когнитивных функций, Т-клетки также увеличиваются в паренхиме.Следует отметить, что возможно, что повреждение миелиновой оболочки, накопление миелинового мусора и дисфункция микроглии, которые мы наблюдаем у наших обезьян (19, 35), приводят к более пагубной реакции Т-клеток в стареющей паренхиме белого вещества мозга приматов. который имеет значительно большую долю ткани белого вещества, чем грызуны (122).

Выводы

Наблюдения, представленные здесь, показывают, что Т-клетки проникают в старое белое вещество мозга при отсутствии инфекции, повреждений или разрушения гематоэнцефалического барьера.Более того, эта инфильтрация связана с возрастными когнитивными нарушениями. Эта инфильтрация Т-клеток в паренхиму стареющего белого вещества представляет собой новое наблюдение, которое может отражать механизм, с помощью которого клетки адаптивной иммунной системы во время нормального старения вносят вклад в нейровоспаление, патологию белого вещества и связанные с этим когнитивные нарушения. Настоящие данные показывают, что у нормальных стареющих приматов Т-клеточная инфильтрация белого вещества мозга, вероятно, является активной инфильтрацией, которая коррелирует с увеличением микроглии с воспалительным фенотипом.Мы предполагаем, что эти проникающие Т-клетки могут быть миелинореактивными из-за повышенного воздействия миелиновых антигенов с возрастом и, таким образом, могут напрямую усугублять патологию миелина при старении. Эти Т-клетки памяти могут активироваться провоспалительной нейросредой (123) и выделять гранзимы, которые могут повредить миелиновую оболочку (124). С другой стороны, инфильтрирующие Т-клетки могут быть регуляторными и проникать в них в попытке смягчить нейровоспаление путем подавления реактивности микроглии (66). Однако, учитывая наши выводы о том, что инфильтрация Т-лимфоцитов в значительной степени связана с ухудшением когнитивных функций, мы полагаем, что Т-клетки, вероятно, будут играть пагубную роль в распространении возрастного нейровоспаления и повреждения миелина.Мы предполагаем, что это может составить модель для разработки более механистических исследований для изучения путей переноса, антиген-специфичности и воспалительного фенотипа Т-клеток, которые инфильтрируют стареющий мозг приматов. Следовательно, эти проникающие Т-клетки представляют собой новую мишень для вмешательств, направленных на замедление или даже обращение вспять возрастного нейровоспаления и когнитивного спада.

Заявление о доступности данных

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без излишних оговорок.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Комитетом по уходу и использованию животных Бостонского университета (IACUC).

Авторские взносы

Экспериментальный дизайн, выполнение и анализ данных KB и DR. Эксперименты по фибриногену в основном проводятся на ПК. Сбор и обработка поведенческих данных с помощью TM. Подготовка и редактирование рукописи всеми.

Финансирование

Эта работа была поддержана грантами NIH: F30-AG063463, RF1-AG043640, RF1-AG062831 и R21-AG061678.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим наш технический персонал: Карен Слейтер, Пенни Шульц и Бетани Боули за их безупречную поддержку.

Список литературы

2. Харада К.Н., Нателсон Лав М.С., Трибель К.Л. Нормальное когнитивное старение. Clin Geriatric Med. (2013) 29: 737–52. DOI: 10.1016 / j.cger.2013.07.002

CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Фриман С.Х., Кандел Р., Круз Л., Розкалне А., Ньюэлл К., Фрош М.П. и др. Сохранение числа нейронов, несмотря на возрастную атрофию коркового слоя головного мозга у пожилых людей без болезни Альцгеймера. J Neuropathol Exp Neurol. (2008) 67: 1205–12. DOI: 10.1097 / NEN.0b013e31818fc72f