Frontiers | Новый пептид-агонист PAR1 демонстрирует защитное действие на мышиной модели ишемии мозга, вызванной фототромбозом

Введение

Повреждение стенки сосуда и нарушение гемостатического баланса приводят к изменению тканевого кровотока и, как следствие, к развитию ишемических состояний (Khoshnam et al., 2017). Активация эндотелиальных клеток — ключевой фактор, инициирующий образование тромба. Широкий спектр рецепторов, регулирующих состояние эндотелия и тромбоцитов, участвует не только в гемостазе, но и в развитии ишемического повреждения головного мозга. Рецепторы, активируемые протеазой (PAR), являются одними из этих рецепторов. PAR принадлежат к семейству рецепторов, связанных с G-белком (GPCR), и регулируют клеточные и физиологические процессы в нормальных и патологических условиях (Ossovskaya, Bunnett, 2004; Coughlin, 2005).

Механизм активации PAR был выявлен и тщательно изучен для PAR1 (Vu et al. , 1991) и других подтипов PAR (Coughlin, 2005). Протеазы расщепляют рецептор в специфическом сайте экзодомена, что приводит к образованию нового N-конца («привязанный лиганд»). Эта N-концевая последовательность взаимодействует со второй внеклеточной петлей и активирует рецептор (Ossovskaya, Bunnett, 2004; Coughlin, 2005). Было показано, что сериновые протеазы системы свертывания крови, тромбин и активированный протеин C (APC), оказывают разнонаправленное действие при эксайтотоксичности и нейровоспалении через активацию PAR1 (Suo et al., 2004; Горбачева и др., 2008; Гриффин и др., 2015).

Тромбин демонстрирует прокоагулянтные эффекты и увеличивает экспрессию провоспалительных и проапоптотических факторов в нервной ткани (Suo et al., 2004; Coughlin, 2005). APC, в отличие от тромбина, защищает нейроны и эндотелий, стабилизирует эндотелиальный барьер и контролирует экспрессию генов цитокинов при повреждении головного мозга (Riewald and Ruf, 2005; Minhas et al., 2009; Zlokovic and Griffin, 2011; Griffin et al. , 2015; Рой и др., 2016).Ранее нами было показано PAR1-зависимое антиапоптотическое действие APC на культивируемые нейроны гиппокампа при эксайтотоксичности глутамата (Горбачева и др., 2009, 2010; Савинкова и др., 2014).

Было обнаружено, что активация PAR1 инициирует разнонаправленные пути через G-белки (Traynelis and Trejo, 2007) и β-аррестины в культивируемых эндотелиоцитах (Soh and Trejo, 2011; Roy et al., 2016). «Молекулярный ансамбль» вокруг рецептора и его паттерн фосфорилирования киназами GPCR обеспечивают этот сигнальный дуализм, называемый «предвзятым агонизмом» (Premont, Gainetdinov, 2007; Reiter et al., 2012). Цитопротективная передача сигналов с помощью APC включает новое расщепление N-концевого домена PAR1 на Arg ⁴⁶ –Asn ⁴⁷ , отличное от такового для тромбина (Arg ⁴¹ –Ser ⁴² ) и активацию β-аррестин-2-зависимого пути. (Сох и Трехо, 2011; Рой и др., 2016). Рекрутирование β-аррестина и активация каркаса Dvl-2 инициируют APC-индуцированную цитопротекцию, опосредованную Rac1. В этом случае активированный Dvl-2 может обеспечивать платформу, которая рекрутирует эффекторные белки, такие как Rac1-специфические факторы обмена гуаниновых нуклеотидов, чтобы способствовать активации Rac1 (Soh and Trejo, 2011).Для APC-индуцированной β-аррестин-2-зависимой передачи сигналов необходима совместная локализация PAR1 с рецептором эндотелиального протеина C и тромбомодулином в кавеолах (Griffin et al., 2015; Roy et al., 2016).

Уникальный механизм активации PAR позволяет применять пептидные аналоги «привязанного лиганда» в качестве агонистов рецепторов (Mao et al., 2008; Ramachandran, Hollenberg, 2008; Mosnier et al., 2013). В настоящей работе мы использовали пептид из девяти аминокислот (AP9, NPNDKYEPF-NH ₂ ), который имитирует N-конец PAR1, начинающийся с остатка Asn ⁴⁷ и генерируемый расщеплением APC по Arg ⁴⁶ .Защитные эффекты AP9 посредством активации PAR1 были подтверждены in vitro с использованием первичных культур нейронов, тучных клеток (Савинкова и др. , 2014; Бабкина и др., 2016) и кератиноцитов человека (Киселева и др., 2014). Более того, ранее было показано, что другой пептидный агонист PAR1, TR47, который также образовался после расщепления PAR1 по Arg ⁴⁶ , демонстрирует общий профиль активности APC (Mosnier et al., 2013). Взятые вместе, эти данные позволяют предположить, что AP9 будет демонстрировать APC-подобные защитные свойства, которые, как ожидается, будут зависимыми от β-аррестина-2, в условиях ишемии in vivo .Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали модель фокальной ишемии головного мозга, индуцированной фототромбозом (ФТ-индуцированную) (Lee et al., 2007; Galkov et al., 2020), и различные схемы внутривенного введения AP9.

PT, основанная на генерации активных форм кислорода под действием света, вызывает повреждение эндотелия и запускает тромбообразование (Lee et al., 2007). Патологические процессы, индуцированные ПТ, аналогичны эндогенно сформированным (Kim et al., 2001; Schroeter et al. , 2002; Li et al., 2014; Канг и др., 2015; Котрина и др., 2017). Более того, фокальная ишемия, индуцированная ПТ, характеризуется низкой инвазивностью и высокой воспроизводимостью объема повреждения (Fluri et al., 2015), а также точной локализацией области поражения в коре головного мозга (Harrison et al., 2013).

В настоящей работе мы исследовали потенциальные эффекты пептида-агониста PAR1, AP9, на мышиной модели ишемии мозга, индуцированной PT. Также была выявлена ​​роль передачи сигналов β-аррестин-2 во внутриклеточных путях, запускаемых AP9.

Материалы и методы

Животные

мышей-самцов массой 25–30 г в возрасте 2,5–3 мес. Животные были получены из питомника лабораторных животных Института биоорганической химии им. Шемякина-Овчинникова РАН, Московская область и содержались в стандартных условиях (температура 22 ° С, световой цикл 12 ч) с неограниченным доступом к воде и воде. еда. Мы использовали мышей BALB / c, мышей с нокаутом β-аррестина-2 (группа β-аррестин-2 — / -), любезно предоставленных проф. Р.Р.Гайнетдинова и животных генетически родственного штамма C57BL / 6 (дикого типа) (Bohn et al., 1999) с полной экспрессией β-аррестина-2. Общее количество использованных животных составляло 177 (141 мышь BALB / c, 20 мышей C57BL / 6 и 16 животных с нокаутом). Шесть мышей BALB / c и одна мышь C57BL / 6 погибли во время индукции ПТ.

Все животные каждой линии были рандомизированы на несколько групп (контрольные группы и группы, получавшие АР9 в разных дозах). Схема рандомизации была создана с использованием сайта Randomization.com. Количество животных в каждой экспериментальной группе ( n ) указано в разделе «Результаты» ( n = 4–10). Все эксперименты проводились в соответствии с Директивой 2010/63 / EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза. Наши экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по биоэтике МГУ им. М.В. Ломоносова (протокол № 2018-10-25-93-0-3). Все измерения проводились вслепую. Исследователь не знал, к какой группе принадлежали животные, при обработке изображений и видеозаписей, а также при экстракции синего красителя Эванса.

Генотипирование мышей

Модификация гена β -аррестин-2 у мышей, проведенная путем гомологичной рекомбинации (Bohn et al., 1999), была подтверждена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Геномную ДНК выделяли из лизатов хвостовых фрагментов мышей дикого типа и мышей с нокаутом β-аррестин-2 с помощью набора Extract DNA («Евроген», Россия). ПЦР проводили с использованием ДНК-полимеразы Taq и стандартного набора реагентов (Thermo Fisher Scientific, США). В процессе ПЦР использовали три праймера (Евроген, Россия): праймеры, фланкирующие сайт встраивания генетической конструкции (прямой 5′-GATCAAAGCCCTCGATGATC-3 ‘и обратный 5′-ACAGGGTCCACTTTGTCCA-3’), а также праймер, комплементарный донору. Последовательность ДНК в гене -аррестин-2 (прямой 5′-GCTAAAGCGCATGCTCCAGA-3 ‘).Продукты ПЦР разделяли на 2% -ном агарозном геле с добавлением бромистого этидия. В качестве маркеров использовали лестницу ДНК NL002 («Евроген», Россия); Визуализацию проводили УФ-светом в трансиллюминаторе. Фрагмент длиной 400 п.н. указывал на наличие нокаутного аллеля, фрагмент в 600 п.н. указывал на аллель дикого типа. В эксперименте отбирали животных, гомозиготных по инактивированному аллелю.

Вестерн-блоттинг

Уровень экспрессии β-аррестина-2

Животных с нокаутом гена и животных дикого типа транскардиально перфузировали гепаринизированным физиологическим раствором (40 единиц / мл).Фрагменты коры головного мозга выделяли на льду и лизировали в буфере RIPA и ингибиторах протеаз (Sigma-Aldrich, США). Образцы, содержащие 20 мкг белка, разделяли с помощью 10% SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и блокировали 5% обезжиренным молоком в TBS-Tween 20 (0,05%) в течение 1 часа. Блот проявляли путем инкубации с антителами против β-аррестина-2 (1: 1000; ab206972, Abcam, Великобритания) и β-актина (1: 1000; ab8227, Abcam, Великобритания) в течение ночи при 4 ° C с последующим инкубация с конъюгированными с пероксидазой хрена антителами против кроличьего IgG (1: 3000; sc-2357, Santa Cruz Biotechnology, США) в течение 1 ч при комнатной температуре.Наличие целевых белков на блотах регистрировали с помощью хемилюминесцентного набора ECL (Thermo Fisher Scientific, США) и ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad Laboratories, США).

Уровень экспрессии GFAP

Контрольным мышам с избыточной анестезией и мышам, получавшим AP9, была сделана транскардиальная перфузия через 96 ч после ПВ. После декапитации мозг изолировали на льду, корковый слой отделяли, а поврежденную ткань мозга в ипсилатеральном полушарии (IH), а также в контралатеральном полушарии (CH) выделяли дисковым ножом диаметром 4 мм.Семьдесят микрограммов белка помещали в один карман геля. Вестерн-блоттинг проводили, как описано выше. Антитела против GFAP (1: 5,000; ab7260, Abcam, Великобритания), GAPDH (1: 5,000; ab181603, Abcam, Великобритания) и конъюгированных с пероксидазой хрена антител против IgG кролика (1: 3,000; sc-2357, Santa Cruz Biotechnology, США). Количественную обработку изображений проводили с помощью программы Image Lab (США). Данные были представлены в виде относительного уровня GFAP, взятого в CH за 1.

Индукция ишемического инсульта

Ишемия была вызвана фототромбозом (Lee et al., 2007; Galkov et al., 2020). Вкратце, для анестезии была выбрана смесь Zoletil 100 (Virbac Sante Animale, Франция) и Xyla (Interchemie werken «De Adelaar» B.V., Нидерланды) в дозах 35 и 3,5 мг / кг (внутрибрюшинно) соответственно. Краситель Rose Bengal (0,15%; Sigma-Aldrich, США) вводили через катетер, помещенный в яремную вену животных, в дозе 10 мг / кг. Участок диаметром 3 мм, локализованный с помощью светонепроницаемой маски в сенсомоторной области коры левого полушария (2.2 мм латеральнее средней линии с эпицентром bregma , Franklin and Paxinos, 2001) освещали зеленым лазером (λ = 532 нм; Viacho, Китай) в течение 5 мин. Освещенность поверхности черепа составляла 55–60 лк (Галков и др., 2020). Мышей умерщвляли передозировкой анестезии через 24 или 96 ч после ПК.

Ранее мы протестировали модель ишемии и показали, что не было повреждения тканей у ложнооперированных мышей (введение физиологического раствора вместо красителя Rose Bengal) согласно данным МРТ и окрашиванию хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия (TTC) (дополнительные Рисунки 1А, Б).Мы также показали, что не было утечки синего красителя Эванса в IH ложно оперированных животных (дополнительный рисунок 1C).

Оценка неврологического статуса

Цилиндр и тесты по сетке были выполнены до индукции ПК и в течение 4 дней после нее в соответствии со стандартным протоколом (Baskin et al., 2003). Количество случаев, когда передняя конечность мыши, противоположная поврежденному полушарию, проходила через отверстия сетки (ошибки шагания), и количество шагов, выполненных этой конечностью, регистрировались на видео в течение 5 мин.Животные, выполнившие менее 100 шагов, были исключены из эксперимента. Сенсомоторный дефицит в цилиндровом тесте рассчитывали по следующей формуле: индекс асимметрии = ( t _после / t _до ) × 100%, где t _после и t _до — относительное время контакта передней контралатеральной конечности (время контакта ипсилатеральной конечности было принято за 100%) после и до ПК, соответственно.На видеозаписи обработано не менее 10 исследований стенок цилиндров каждым животным.

Измерение объема ишемического повреждения

Объем поражения оценивали с помощью МРТ и окрашивания срезов головного мозга ТТС. МРТ-исследования проводили через 24 и 96 ч после ФТ на МР-сканере 7,05 Тл BioSpec 70/30 USR (Bruker, Германия), оборудованном быстрыми градиентами (скорость нарастания 105 мТл / м / мс). Мы получили T ₂ -взвешенные МРТ-изображения с использованием метода 2D RARE со следующими параметрами сканирования: TR / Teeff = 3000/50 мс; количество ломтиков: 16; толщина среза: 0.4 мм; редко-фактор: 4; плоскостное разрешение: 100 × 100 м; общее время сбора данных: 9 мин 00 с. Для измерения объема поражения с использованием окрашивания ТТС животных декапитировали через 24 часа после тромбоза и удаляли головной мозг. Объем повреждений оценивался по стандартному протоколу, как описано ранее (Галков и др., 2020).

Цифровые изображения обрабатывали в программе ImageJ (NIH, США). Объем повреждения рассчитывался с учетом увеличения размера IH в результате отека по сравнению с CH (Pialat et al., 2007). Данные были представлены в виде относительного объема поражения. Этот параметр у контрольных мышей был установлен равным 100%.

Измерение проницаемости гематоэнцефалического барьера

Голубой краситель Evans (Sigma-Aldrich, США) вводили внутривенно через катетер сразу после лазерного облучения (80 мг / кг, 2,2% раствор). Через 24 ч после индукции ПВ мышам проводили транскардиальную перфузию гепаринизированным физиологическим раствором (40 единиц / мл). Для оценки проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) экстракцию красителя и определение его содержания в обоих полушариях проводили, как описано ранее (Kim et al., 2001). Данные были выражены как относительное содержание синего Эванса в IH. Этот параметр в CH был принят за 100%.

Обработка тканей и гистологический анализ

Животных с избыточной анестезией выполняли транскардиальную перфузию 0,1 М фосфатным буферным солевым раствором (PBS) и 10% формалином через 24 или 96 ч после индукции ПВ. Для иммуногистохимии мозг удаляли, фиксировали в течение 24 ч, промывали PBS и последовательно инкубировали в 10, 20 и 30% сахарозе при комнатной температуре. Затем мозг встраивали в матрицу встраивания ОКТ (CellPath, Великобритания), замораживали и хранили при -80 ° C.Для окрашивания гематоксилин-эозином головной мозг удаляли, фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24 часов, заливали парафином и разрезали на 5-мкм срезы, которые окрашивали.

Для каждого животного подсчет клеток проводили в двух срезах центральной части поражения, отстоящих друг от друга не менее чем на 200 мкм. Клетки подсчитывали в четырех неперекрывающихся полях (300 × 220 мкм) каждого среза как в IH, так и в CH. Поля зрения равномерно покрывали область полутени и располагались на внешней границе ишемического ядра в поврежденном полушарии.При ХГ мы выбрали зеркальные области коры для подсчета клеток (Галков и др., 2020). Изображения обрабатывались в программе ImageJ; полученные данные усреднялись для одного животного.

Окрашивание гематоксилином-эозином

Долю неповрежденных нейронов оценивали через 24 ч после тромбоза. Нейроны, не характеризовавшиеся ядерным пикнозом, кариорексисом, кариолизом, гиперхромией, набуханием и изменением нормальной формы клеток (Hu et al., 2002; Song et al., 2012; Galkov et al., 2020) считались неповрежденными ячейками. Данные представлены в виде относительного количества неповрежденных нейронов в полутени (аналогичный показатель в СН принят за 100%).

Иммуногистохимия

Количество активированных глиальных клеток оценивали через 96 ч после тромбоза. Коронковые криосрезы толщиной 15 мкм иммуноокрашивали антителами против GFAP (1: 500; ab10062, Abcam, Великобритания) и Iba-1 (1: 500; 019-19741, Вако, Япония). Вторичные антитела конъюгировали с флуорофором Alexa Fluor 594 [антимышиный IgG (1: 1000; R37121) или антикроличий IgG (1: 1000; A-11037), Thermo Fisher Scientific, США].Ядра клеток окрашивали DAPI (Biotium, США). Изображения получали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 710 (Zeiss, Германия). Подсчитывали количество GFAP-позитивных клеток (в двух-четырех слоях коры головного мозга, Cotrina et al., 2017) и Iba-1-позитивных клеток. Данные представлены в виде относительных величин, взятых в CH для 1.

Структура AP9 и схема ее администрирования

Активированный протеазой пептид-агонист рецептора 1 (AP9), состоящий из девяти аминокислот (NPNDKYEPF-NH ₂ ), был синтезирован в Лаборатории синтеза пептидов Национального медицинского исследовательского центра кардиологии (Москва) с использованием твердофазного Fmoc. синтез.Гомогенность пептида подтверждена данными аналитической ВЭЖХ.

Первоначально мы использовали три дозы AP9 (0,2, 2 и 20 мг / кг), растворенные в физиологическом растворе, в концентрациях 0,06, 0,6 и 6 мг / мл соответственно. Введение AP9 осуществляли внутривенно за 10 мин до индукции ПВ (Abdelkarim et al., 2001) через катетер (в виде болюса). В следующей серии экспериментов введение АР9 в дозе 20 мг / кг, показавшее максимальную эффективность, проводили за 10 мин до тромбоза и через 1 ч после ПВ.

Статистический анализ

Статистический анализ выполнен с использованием программы GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., США). Тест нормальности Д’Агостино – Пирсона использовался для определения соответствия данных выборки нормальному распределению ( p > 0,1). Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Различия между группами считались статистически значимыми при p <0,05. Количество животных ( n ) и статистические критерии показаны для каждого эксперимента.Анализ мощности, выполненный с помощью программы STATISTICA (StatSoft Inc., США), показал, что статистическая мощность была более 0,8 в случае обнаружения статистически значимых различий между группами данных.

Результаты

Влияние AP9 на объем поражения головного мозга после фототромбоза

МРТ использовался для определения объема повреждения головного мозга, который напрямую отражает тяжесть ишемии. Мы обнаружили, что эффекты AP9 были дозозависимыми. AP9 в дозе 20 мг / кг (однократная инъекция за 10 мин до ПВ) вызывал статистически значимое уменьшение объема поражения, которое составило 69.92 ± 8,21% ( n = 7) в группе, обработанной AP9, по сравнению с контрольными животными (100,00 ± 6,10%, n = 7) через 24 часа после индукции PT. Однако мы не наблюдали влияния AP9 в дозах 0,2 и 2 мг / кг на этот параметр, который составил 92,70 ± 10,10% ( n = 4) и 100,90 ± 5,96% ( n = 4), соответственно. (Рисунки 1А, Б).

Рис. 1. Влияние AP9 на объем поражения головного мозга после фототромбоза. (A, B) Однократное введение AP9 в дозах 0.2, 2 и 20 мг / кг: (A) относительный объем ишемического повреждения (односторонний дисперсионный анализ с поправкой Даннета для множественных сравнений) и (B) репрезентативных МР-изображений на уровне bregma (повреждено области отмечены треугольниками) через 24 ч после тромбоза. (C, D) Двойное введение AP9 в дозе 20 мг / кг: (C) относительный объем ишемического повреждения (непарный t -тест) и (D) репрезентативные МРТ-изображения на уровень bregma (поврежденные участки отмечены треугольниками) через 24 и 96 ч после тромбоза (*: по сравнению с контрольной группой).

Повторное введение пептида (т.е. за 10 мин до и через 1 час после ПВ) в дозе 20 мг / кг усиливало защитный эффект его однократной инъекции и приводило к статистически значимому двукратному уменьшению объема поражения через 24 ч после тромбоз. Объем повреждения составил 48,59 ± 6,42% ( n = 7) в группе, обработанной AP9, и 100,00 ± 7,27% ( n = 7) в контрольной группе. Кроме того, мы также оценили объем поражения через 96 ч после тромбоза. Это было 53,21 ± 9,72% в группе, получавшей AP9, относительно контрольного значения (100.00 ± 5,58%) (Рисунки 1C, D). Таким образом, результаты МРТ свидетельствовали о сохранении защитного эффекта двукратного введения АР9 в постишемическом периоде.

AP9 не влиял на морфологические изменения нейронов, вызванные фототромбозом

Патологические изменения, возникающие после индукции ишемии на клеточном уровне, оценивали путем окрашивания гематоксилин-эозином срезов мозга. Выявлено достоверное уменьшение количества нейронов без морфологических признаков повреждения в полутени по сравнению с аналогичными участками при СН через 24 ч после ПТ ​​(рис. 2).

Рисунок 2. Морфологические изменения нейронов через 24 часа после тромбоза у контрольных животных и мышей, получавших АР9 (однократная инъекция, 0,2, 2 и 20 мг / кг). (A) Относительное количество неповрежденных нейронов в полутени (односторонний дисперсионный анализ). (B) Репрезентативные микрофотографии области полутени в IH и типичная микрофотография зеркальной области в CH (окрашивание гематоксилин-эозином; стрелки указывают клетки с нормальной морфологией, треугольники указывают клетки с признаками повреждения).

Однократная инъекция пептида во всех трех использованных дозах (0,2, 2 и 20 мг / кг) не влияла на долю неповрежденных нейронов в ИГ по сравнению с контрольной группой. Эти доли составили 14,14 ± 3,93% ( n = 5), 16,70 ± 4,74% ( n = 5) и 12,40 ± 1,50% ( n = 7) при дозах 0,2, 2 и 20 мг / кг. кг AP9 соответственно. В контрольной группе животных область полутени содержала 17,80 ± 2,30% ( n = 8) нейронов без признаков повреждения (рис. 2).

Две инъекции (10 мин до и 1 ч после ПВ) АР9 в дозе 20 мг / кг также не изменили относительное количество неповрежденных нейронов в ИГ. Полутень характеризовалась 26,56 ± 5,47% ( n = 5) нейронов нормальной морфологии в контрольной группе животных и 24,85 ± 6,74% ( n = 7) у мышей, получавших AP9 (рис. 3).

Рисунок 3. Морфологические изменения нейронов через 24 часа после тромбоза у контрольных животных и мышей, получавших АР9 (двойная инъекция, 20 мг / кг). (A) Относительное количество неповрежденных нейронов в полутени (непарный t -тест). (B) Репрезентативные микрофотографии области полутени в IH и типичная микрофотография зеркальной области в CH (окрашивание гематоксилин-эозином; стрелки указывают клетки с нормальной морфологией, треугольники указывают клетки с признаками повреждения).

Введение AP9 не изменило индуцированную фототромбозом активацию глиальных клеток

Согласно литературным данным, значительная активация и пролиферация глиальных клеток наблюдается в полутени через 96 ч после индукции ПТ.Это подтверждается повышенной экспрессией GFAP в активированных астроцитах (Li et al., 2014; Cotrina et al., 2017) и Iba-1 в активированных микроглиальных клетках / макрофагах (Li et al., 2014).

В настоящем исследовании мы также наблюдали значительное увеличение количества активированных глиальных клеток в IH по сравнению с CH через 96 ч после индукции тромбоза. Однако влияния двукратного введения АР9 (20 мг / кг за 10 мин до и через 1 ч после тромбоза) на эти показатели не обнаружено. Относительное количество активированных астроцитов (GFAP-положительных клеток) в полутени было 8.17 ± 0,51 ( n = 5) и 8,55 ± 0,37 ( n = 6) у контрольных и обработанных AP9 животных, соответственно (фигуры 4A, B). Для активированных микроглиоцитов / макрофагов (Iba-1-положительные клетки) значения составили 6,89 ± 1,04 (контрольная группа, n = 5) и 8,52 ± 0,96 (экспериментальная группа, n = 6) (рисунки 4C, D). .

Фигура 4. Активация глиальных клеток через 96 часов после тромбоза у контрольных животных и мышей, получавших AP9 (двойная инъекция, 20 мг / кг). (A, B) Иммуногистохимические данные по окрашиванию GFAP: (A) относительное количество активированных астроцитов (непарные t -тест) и (B) репрезентативные микрофотографии полутени. (C, D) Иммуногистохимические данные по окрашиванию Iba-1: (C) относительное количество активированных микроглиоцитов / макрофагов (непарный t -тест) и (D) репрезентативные микрофотографии полутени (GFAP- и Iba-1-положительные клетки отмечены треугольниками).

подтвердил отсутствие разницы между контрольной группой и животными, получавшими AP9 (20 мг / кг, двойное введение), в экспрессии GFAP через 96 часов после фототромбоза. Относительный уровень GFAP у контрольных животных составил 26,74 ± 3,01 в IH и 1,00 ± 0,09 в CH ( n = 4). У мышей, получавших AP9, этот параметр составлял 26,09 ± 2,30 и 1,00 ± 0,10 ( n = 4) в IH и CH, соответственно (дополнительный рисунок 2).

Влияние AP9 на нарушение ГЭБ после тромбоза

Экстракция синего красителя Эванса — эффективный инструмент для оценки функционального состояния ГЭБ после экспериментальной ишемии (Belayev et al., 1996; Ким и др., 2001). Согласно литературным данным, максимальное нарушение целостности сосудов головного мозга после ПТ ​​наблюдается в первые сутки после ее индукции (Kang et al., 2015). По этой причине мы выполнили экстракцию красителя из IH и CH через 24 часа после операции, чтобы оценить потенциальные защитные свойства AP9.

Однократное введение АР9 в дозе 20 мг / кг не повлияло на содержание синего красителя Эванса в поврежденном полушарии. Этот показатель составил 294,40 ± 26,88% ( n = 5) и 308%.60 ± 28,98% ( n = 5) у контрольных мышей и мышей, получавших AP9, соответственно (фиг. 5A, B). Однако двойная инъекция АР9 (20 мг / кг за 10 мин до и через 1 час после тромбоза) продемонстрировала защитный эффект. Относительное содержание красителя в ИГ составило 382,40 ± 18,67% ( n = 6) у контрольных животных. У мышей, получавших AP9, этот параметр статистически значимо снизился до 321,10 ± 15,69% ( n = 7) (рисунки 5C, D).

Рисунок 5. Эффекты AP9 на индуцированное РТ разрушение ГЭБ через 24 часа после тромбоза. (A, B) Однократное введение AP9 (20 мг / кг): (A) относительное содержание синего красителя Эванса в IH (непарный t -тест) и (B) репрезентативные фотографии всего мозги. (C, D) Двойное введение AP9 (20 мг / кг): (C) относительное содержание красителя Эванса в IH (непарный t -тест) и (D) репрезентативные фотографии всего мозг (треугольниками обозначены поврежденные полушария).

Влияние AP9 на индуцированный фототромбозом сенсомоторный дефицит у мышей

Сенсомоторный дефицит, развивающийся у животных после экспериментальной ишемии, является комплексным показателем тяжести данной патологии на уровне всего организма.В настоящем исследовании мы использовали тесты с цилиндром и сеткой, которые ранее показали высокую эффективность в обнаружении сенсомоторной дисфункции у мышей (Baskin et al., 2003; Galkov et al., 2020).

Мы обнаружили, что двойная инъекция AP9 в дозе 20 мг / кг улучшила неврологический статус мышей в обоих тестах. В тесте с обходом по сетке мыши, получавшие AP9, совершали меньше ошибок при шаге (8,88 ± 1,18 ошибок / 100 шагов, n = 9) по сравнению с контрольной группой (14,92 ± 3,00, n = 7, два животных были исключены. из эксперимента из-за недостаточного количества выполненных шагов) через 24 ч после индукции PT (рис. 6A).Статистически значимое снижение индекса асимметрии, измеренного в тесте с цилиндром, развилось в контрольной группе через 96 ч после индукции ПВ (73,64 ± 6,61 и 100,00 ± 2,93% через 96 ч после индукции ПВ и до тромбоза соответственно; n = 7 ). Это снижение было менее выражено в группе, подвергшейся лечению AP9 (84,00 ± 3,44 и 100,00 ± 2,39%, соответственно; n = 8) (Рисунок 6B).

Фигура 6. Влияние двойного введения АР9 (20 мг / кг, 10 мин до и 1 ч после ПВ) на индуцированный ПВ сенсомоторный дефицит у мышей. (A) Данные теста обхода сетки. (B) Данные теста цилиндра (двусторонний дисперсионный анализ с поправкой Шидака для множественных сравнений, *: по сравнению с соответствующим контрольным значением, #: по сравнению со значением до PT).

Влияние нокаута β-аррестина-2 на защитное действие AP9 в PT

Мы использовали мышей, лишенных β-аррестина-2 (Bohn et al., 1999), чтобы выявить вклад этого белка в защитные эффекты AP9. Согласно данным, полученным при генотипировании животных методом ПЦР, все мыши с β-аррестин-2 — / — имели нокаут обоих аллелей целевого гена в отличие от животных дикого типа.Результаты вестерн-блоттинга полностью подтвердили отсутствие экспрессии β-аррестина-2 у животных с нокаутом (фигура 7A).

Фиг. 7. Влияние нокаута β-аррестина-2 на защитное действие AP9 через 24 часа после тромбоза. (A) Подтверждение нокаута гена β -аррестин-2 [результаты анализа ПЦР (вверху) и вестерн-блоттинга (внизу)]. (B) AP9 (20 мг / кг, двойное введение: 10 мин до и 1 час после ПВ) влияние на относительный объем поражения через 24 часа после ПВ у мышей дикого типа и мышей с нокаутом гена (непарный t -тест для каждой группы животных). (C) Репрезентативные изображения срезов мозга на уровне bregma (окрашивание TTC; поврежденные области отмечены треугольниками).

Мы использовали TTC-окрашивание срезов головного мозга для оценки объема поражения. AP9 (20 мг / кг, 10 минут до и 1 час после PT) значительно уменьшал относительный объем поражения у животных дикого типа (штамм C57BL / 6) через 24 часа после PT. Этот параметр составлял 70,80 ± 8,28% ( n = 9) в обработанной группе и 100,00 ± 9,56% ( n = 10) у контрольных мышей (Фигуры 7B, C).Это соответствовало нашим данным МРТ мышей BALB / c. Однако мы не обнаружили защитного эффекта двойной инъекции АР9 у мышей β-аррестин-2 — / -. Объем поражения составлял 100,00 ± 11,63% ( n = 8) у контрольных животных и 89,82 ± 6,91% ( n = 8) у мышей, обработанных AP9 (Фигуры 7B, C). Таким образом, экспрессия β-аррестина-2 необходима для защитного действия AP9 при ишемии мозга, вызванной PT.

Обсуждение

Участие гемостатических протеаз в регуляции дисфункций, вызванных ишемией головного мозга, было продемонстрировано ранее (Xi et al., 2003; Гриффин и др., 2004; Суо и др., 2004; Шихан и Цирка, 2005). Особый интерес представляют данные о защитных эффектах APC и пептидных аналогов «связанного лиганда» PAR1, генерируемого расщеплением APC по Arg ⁴⁶ . В нашей лаборатории изучали действие девяти аминокислотного пептида AP9, состоящего из Asn ⁴⁷ –Phen ⁵⁵ «привязанного лиганда» PAR1 в культивируемых нейронах, тучных клетках и кератиноцитах. Мы показали, используя селективные блокаторы PAR1, что AP9 увеличивает выживаемость нейронов после их совместного культивирования с активированными тучными клетками через PAR1 (Бабкина и др., 2016). Кроме того, пептид уменьшал гибель нейронов в эксайтотоксических условиях (Савинкова и др., 2014) и ускорял заживление ран in vitro (Киселева и др., 2014). Сходство PAR1-зависимого действия AP9 и APC указывает на возможность реализации эффекта AP9 через APC-подобные пути.

В настоящем исследовании мы впервые продемонстрировали защитные свойства AP9 на мышиной модели ишемического инсульта. AP9, введенный за 10 мин до ПВ в дозе 20 мг / кг, уменьшал объем повреждения головного мозга.Двойное введение АР9 (20 мг / кг) за 10 минут до и через 1 час после ПВ, то есть в рамках «терапевтического окна» (Danton and Dietrich, 2004), уменьшило не только объем поражения, но также нарушение ГЭБ и неврологический дефицит мышей.

Известно, что PAR1 экспрессируется разными компонентами нервно-сосудистой единицы: нейронами (Junge et al., 2004; Горбачева и др., 2009), астроцитами (Bartha et al., 2000; Wang et al., 2002; Junge et al., 2004) и эндотелиальные клетки (Bartha et al., 2000).Соответственно, различные типы клеток можно рассматривать как потенциальную мишень для AP9. Более того, индуцированное РТ разрушение ГЭБ увеличивает возможность пересечения ГЭБ пептидом и приводит к расширению спектра его клеточных мишеней.

Обработка девяти аминокислотным пептидом уменьшала объем поражения, измеренный с помощью МРТ и содержания красителя Эванса синего в поврежденном полушарии после ПК. МРТ визуализирует области мозга, характеризующиеся образованием отека (Hoehn et al., 2001), а экстракция синего красителя Эванса позволяет оценить функциональное состояние ГЭБ (Belayev et al., 1996). Это указывает на то, что эффекты AP9 в первую очередь обусловлены стабилизацией функции эндотелиального барьера после ишемии, вызванной PT. Наши результаты согласуются с предыдущими данными для пептидного агониста PAR1 TR47, то есть С-концевого фрагмента PAR1, образованного после расщепления рецептора APC по Arg ⁴⁶ . TR47 ингибирует проницаемость эндотелия in vitro, и in vivo, сосудистую утечку у мышей посредством APC-подобной активации Rac1 (Mosnier et al., 2013).

Наблюдаемые эффекты AP9 аналогичны описанным для APC. В культивируемых эндотелиоцитах APC подавляет гены, модулируемые NF-κB, и подавляет передачу сигналов цитокинов. Более того, APC модулирует пути апоптоза, включая активацию эндотелиального гомолога Bcl-2 (A1), эндотелиальной NO-синтазы и ингибитора апоптоза (IAP) (Joyce et al., 2001; Riewald and Ruf, 2005). APC также активирует ось Ang1 / Tie-2 (Minhas et al., 2009) и увеличивает синтез S1P (Feistritzer and Riewald, 2005; Finigan et al., 2005), уменьшая нарушение эндотелиального барьера. Возможно, что все эти эффекты могут запускаться в эндотелиоцитах мозга через активацию PAR1 с помощью AP9.

Несмотря на то, что полезные эффекты AP9 были продемонстрированы на нейроны гиппокампа в эксайтотоксических условиях (Савинкова и др., 2014), а также после их совместного культивирования с активированными тучными клетками (Бабкина и др., 2016), здесь AP9 не оказывал нейропротекторного действия. действие согласно гистологическому анализу. Возможно, что помимо эксайтотоксичности глутамата и активации иммунных клеток другие факторы вызывают гибель нейронов в ишемических условиях in vivo (Durukan and Tatlisumak, 2007).Таким образом, прямое сравнение результатов экспериментов in vivo, и in vitro, неприменимо. Более того, отсутствие воздействия AP9 на нейроны, по-видимому, связано со способом введения пептида. Ожидается, что эндотелиальные клетки будут прямой мишенью для пептида после его внутривенной инъекции, что подтверждается AP9-опосредованной стабилизацией BBB после PT. Однако, согласно данным сенсомоторных тестов, пептид не только влияет на эндотелиоциты, но и косвенно защищает другие типы клеток, регулируя отек, индуцированный PT.По-видимому, AP9 предотвращает повреждение клеток в различных компонентах нервно-сосудистой единицы с помощью различных цитопротекторных путей, подобных APC (Рисунок 8). В то же время молекулярный механизм действия AP9 требует дальнейшего детального изучения.

Рисунок 8. Защитные эффекты AP9 и возможных пептидных цитопротекторных путей, аналогичные тем, которые индуцируются APC (Ang1, ангиопоэтин 1; AP9, девяти аминокислотный пептидный аналог PAR1 «привязанный лиганд»; APC, активированный протеин C ; CAV1, кавеолин-1; EPCR, рецептор эндотелиального протеина C; GRK 5/6, рецепторные киназы 5 и 6, связанные с G-белком; NF-κBp65, субъединица p65 ядерного фактора κB; PAR1, рецептор 1, активируемый протеазой; PT, фототромбоз; Rac1, GTPase; S1P, сфингозин-1-фосфат; Tie-2, рецептор ангиопоэтина; красные стрелки указывают цитопротективные пути, запускаемые APC, а синие стрелки и линии указывают эффекты AP9, наблюдаемые в настоящем исследовании).

APC-подобный механизм действия AP9 подтверждается данными, полученными на животных с нокаутом по β-аррестин-2. Отсутствие защитного эффекта AP9 у мышей, лишенных β-аррестина-2, указывает на то, что AP9 может запускать β-аррестин-2-зависимые пути. β-Аррестин-2 привлекает многие эффекторные белки и обеспечивает независимую от G-белка передачу сигналов через механизм «предвзятого агонизма» (рис. 8) (Soh and Trejo, 2011; Griffin et al., 2015; Roy et al., 2016) . Ранее было показано, что локализация PAR1 в кавеолах и его ассоциация с β-аррестинами необходимы для активации Rac1, который является ключевым участником APC-опосредованных цитопротекторных каскадов (Soh and Trejo, 2011).

Заключение

В заключение, новый пептид-агонист PAR1 (NPNDKYEPF-NH ₂ ) демонстрирует APC-подобные защитные эффекты на мышиной модели ишемии мозга, индуцированной PT. Мы предполагаем, что действие AP9 опосредовано его воздействием на нервно-сосудистую единицу и клетки мозга. Молекулярный механизм действия AP9 аналогичен APC. Активация PAR1 с помощью AP9, а также APC-опосредованное расщепление PAR1 индуцируют β-аррестин-2-зависимые цитопротективные пути. Наше исследование показывает потенциальную стратегию лечения ишемического повреждения мозга, основанную на новом классе пептидных нейропротекторов.

Наборы данных, созданные для этого исследования, доступны по запросу соответствующему автору.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Комитетом по биоэтике МГУ им. М.В. Ломоносова.

Авторские взносы

MGa провела исследование, проанализировала данные и написала рукопись. ЭК провела гистологическое исследование. МГУ провел МРТ-исследования. МС осуществил синтез пептидов.LG разработала исследование и отредактировала рукопись. Все авторы внесли свой вклад в доработку рукописи, прочитали и одобрили представленную версию.

Финансирование

Работа MGa поддержана университетской программой «УМНИК» (МГУ им. М.В. Ломоносова, 2018, проект № 14587Гр / 2019) и Российским фондом фундаментальных исследований (проект № 18-34-00977). Частично работы ЭК выполнялись в рамках Государственной программы фундаментальных научных исследований ИДБ РАН (проект №0108-2019-0004).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Благодарим Александру Гусеву (МГУ им. М.В. Ломоносова) и Илью Гусева за помощь в обслуживании лазерного оборудования. Коллектив авторов также благодарен Дмитрию Горбачеву (Институт биоорганической химии им. Шемякина-Овчинникова РАН) и Владимиру Вьюшкову (МГУ им. М.В. Ломоносова) за помощь в генотипировании мышей и интерпретации полученных данных.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnins.2020.00335/full#supplementary-material

Сноски

Список литературы

Абделькарим Г., Герц К., Хармс К., Качанов Дж., Дирнагл У., Сабо К. и др. (2001). Защитные эффекты PJ34, нового мощного ингибитора поли (АДФ-рибоза) полимеразы (PARP) в моделях инсульта in vitro и in vivo. Внутр. J. Mol. Med. 7, 255–260. DOI: 10.3892 / ijmm.7.3.255

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бабкина И. И., Струкова С. М., Пинелис В. Г., Райзер Г., Горбачева Л. Р. (2016). Новый синтетический пептид защищает нейроны от гибели, вызванной токсическим воздействием активированных тучных клеток через рецептор, активируемый протеазой. Биохимия 10, 126–134. DOI: 10.1134 / S19816010037

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Барта, К., Домотор, Э., Ланца, Ф., Адам-Визи, В., и Махович, Р. (2000). Идентификация рецепторов тромбина в эндотелиальных клетках капилляров головного мозга крыс. J. Cereb. Blood Flow Metab. 20, 175–182. DOI: 10.1097 / 00004647-200001000-00022

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баскин, Ю. К., Дитрих, В. Д., и Грин, Э. Дж. (2003). Две эффективные поведенческие задачи для оценки сенсомоторной дисфункции после черепно-мозговой травмы у мышей. Дж.Neurosci. Методы 129, 87–93. DOI: 10.1016 / S0165-0270 (03) 00212-7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Беляев Л., Бусто Р., Чжао В. и Гинзберг М. Д. (1996). Количественная оценка проницаемости гематоэнцефалического барьера после окклюзии средней мозговой артерии у крыс. Brain Res. 739, 88–96. DOI: 10.1016 / S0006-8993 (96) 00815-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бон, Л. М., Лефковиц, Р. Дж., Гайнетдинов, Р. Р., Пеппель, К., Кэрон, М. Г., и Лин, Ф.-Т. (1999). Усиление обезболивания морфином у мышей, лишенных β-аррестина-2. Science 286, 2495–2498. DOI: 10.1126 / science.286.5449.2495

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Котрина М. Л., Лу Н., Томе-Гарсия Дж., Гольдман Дж. И Недергаард М. (2017). Прямое сравнение динамики микроглии и профиля воспаления при инсульте, вызванном фототромботической и артериальной окклюзией. Неврология 343, 483–494. DOI: 10.1016 / j.neuroscience.2016.12.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дантон Г. Х. и Дитрих В. Д. (2004). Поиск нейропротективных стратегий при инсульте. Am. J. Neuroradiol. 25, 181–194.

Google Scholar

Дурукан, А., Татлисумак, Т. (2007). Острый ишемический инсульт: обзор основных экспериментальных моделей грызунов, патофизиология и терапия очаговой церебральной ишемии. Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179–197. DOI: 10.1016 / j.pbb.2007.04.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Файстрицер К. и Ривальд М. (2005). Защита эндотелиального барьера с помощью активированного протеина C посредством PAR1-зависимой перекрестной активации сфингозин-1-фосфатного рецептора-1. Кровь 105, 3178–3184. DOI: 10.1182 / кровь-2004-10-3985

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Финиган, Дж. Х., Дудек, С. М., Синглтон, П.А., Чанг, Э. Т., Якобсон, Дж. Э., Кэмп, С. М. и др. (2005). Активированный протеин C обеспечивает новое усиление эндотелиального барьера легких: роль трансактивации сфингозин-1-фосфатного рецептора. J. Biol. Chem. 280, 17286–17293. DOI: 10.1074 / jbc.M412427200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Fluri, F., Schuhmann, M. K., and Kleinschnitz, C. (2015). Модели ишемического инсульта на животных и их применение в клинических исследованиях. Drug Des.Devel. Ther. 9, 3445–3454. DOI: 10.2147 / DDDT.S56071

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Франклин, К. Б. Дж., И Паксинос, Г. (2001). Мозг мыши в стереотаксических координатах , 2-е изд., Лондон: Academic Press.

Google Scholar

Галков М., Гуляев М., Киселева Е., Андреев-Андриевский А., Горбачева Л. (2020). Методы выявления повреждений головного мозга после ишемии, вызванной фототромбозом у мышей: характеристика и новые аспекты их применения. J. Neurosci. Методы 329, 1–9. DOI: 10.1016 / j.jneumeth.2019.108457

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Горбачева, Л., Пинелис, В., Ишива, С., Струкова, С., Райзер, Г. (2010). Активированный протеин C предотвращает вызванную глутаматом и тромбином активацию ядерного фактора-κB в культивируемых нейронах гиппокампа. Неврология 165, 1138–1146. DOI: 10.1016 / j.neuroscience.2009.11.027

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Горбачева Л.Р., Давыдова, О., Соколова, Э., Ишива, С., Пинелис, В. Г., Струкова, С. М. и др. (2009). Рецептор эндотелиального протеина C экспрессируется в нейронах коры и гиппокампа крысы и необходим для защитного действия активированного протеина C при экзитотоксичности глутамата. J. Neurochem. 111, 967–975. DOI: 10.1111 / j.1471-4159.2009.06380.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Горбачева Л. Р., Сторожевых Т. П., Пинелис В. Г., Давыдова О.Н., Ишивата, С., Струкова, С. М. (2008). Активированный протеин C через рецептор PAR1 регулирует выживание нейронов в условиях эксайтотоксичности глутамата. Биохимия 73, 717–724. DOI: 10.1134 / S0006297

0138

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гриффин, Дж. Х., Фернандес, Дж. А., Ченг, Т., Го, Х. и Злокович, Б. В. (2004). Активированный протеин С и ишемический инсульт. Crit. Care Med. 32, 247–253. DOI: 10.1097 / 01.CCM.0000126127.87484.2B

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Харрисон, Т. К., Силаси, Г., Бойд, Дж. Д., и Мерфи, Т. Х. (2013). Смещение сенсорных карт и дезорганизация моторной коры после целевого инсульта у мышей. Инсульт 44, 2300–2306. DOI: 10.1161 / STROKEAHA.113.001272

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хоэн, М., Николай, К., Франке, К., Санден, Ю., и ван дер, Б. (2001). Применение магнитного резонанса к моделям церебральной ишемии на животных. J. Magn. Резон. Imaging 14, 491–509. DOI: 10.1002 / jmri.1213

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ху, X. Л., Йоханссон, И. М., Бреннстрем, Т., Олссон, Т., и Вестер, П. (2002). Длительная гибель нейрональных апоптотических клеток в регионах с тяжелой ишемией после удара фототромботическим кольцом у крыс. Acta Neuropathol. 104, 462–470. DOI: 10.1007 / s00401-002-0579-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джойс, Д.Э., Гельберт, Л., Чачча, А., Дехофф, Б., и Гриннелл, Б. В. (2001). Профиль экспрессии генов антитромботического протеина C определяет новые механизмы, модулирующие воспаление и апоптоз. J. Biol. Chem. 276, 11199–11203. DOI: 10.1074 / jbc.C100017200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Юнг, К. Э., Ли, К. Дж., Хаббард, К. Б., Чжан, З., и Олсон, Дж. Дж. (2004). Активированный протеазой рецептор-1 в головном мозге человека: локализация и функциональная экспрессия в астроцитах. Exp. Neurol. 188, 94–103. DOI: 10.1016 / j.expneurol.2004.02.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Канг, Х., Сон, И., и Парк, К. (2015). Использование индоцианинового зеленого для оптического анализа кортикальных инфарктов в фототромботическом ишемическом мозге. J. Neurosci. Методы 248, 46–50. DOI: 10.1016 / j.jneumeth.2015.03.033

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хошнам, С.Э., Уинлоу, В., Фарзане, М., Фарбуд, Й., Могхаддам, Х. Ф. (2017). Патогенетические механизмы после ишемического инсульта. Neurol. Sci. 38, 1167–1186. DOI: 10.1007 / s10072-017-2938-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ким, Г. В., Копин, Дж .-К., Левен, А., Уотсон, Б. Д., и Чан, П. Х. (2001). Цитозольный антиоксидант, супероксиддисмутаза меди / цинка, ослабляет нарушение гематоэнцефалического барьера и окислительное клеточное повреждение после фототромботической ишемии коры головного мозга у мышей. Неврология 105, 1007–1018. DOI: 10.1016 / S0306-4522 (01) 00237-8

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Киселева Е. В., Сидорова М. В., Горбачева Л. Р., Струкова С. М. (2014). Пептид-агонист рецептора, активируемого протеазой (PAR1), аналогично активированному протеину C, способствует пролиферации кератиноцитов и заживлению ран эпителиального слоя. Biomed. Хим. 60, 702–706. DOI: 10.18097 / pbmc20146006702

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Дж.-К., Пак, М.-С., Ким, Ю.-С., Мун, К.-С., Джу, С.-П., и Ким, Т.-С. (2007). Фотохимически индуцированная церебральная ишемия на мышиной модели. Surg. Neurol. 67, 620–625. DOI: 10.1016 / j.surneu.2006.08.077

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Li, H., Zhang, N., Lin, H., Yu, Y., Cai, Q., Ma, L., et al. (2014). Гистологические, клеточные и поведенческие оценки исходов инсульта после ишемии, вызванной фототромбозом, у взрослых мышей. BMC Neurosci. 15:58. DOI: 10.1186 / 1471-2202-15-58

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мао, Ю., Цзинь, Дж., И Кунапули, С. П. (2008). Характеристика нового пептидного агониста рецептора-1, активируемого протеазой. Biochem. Pharmacol. 75, 438–447. DOI: 10.1016 / j.bcp.2007.09.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Минхас, Н., Сюэ, М., Фукудоме, К., и Джексон, К. Дж. (2009). Активированный протеин C использует ось ангиопоэтин / Tie-2 для обеспечения функции эндотелиального барьера. FASEB J. 24, 873–881. DOI: 10.1096 / fj.09-134445

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Моснье, Л.О., Синха, Р.К., Берньер, Л., Бувенс, Э.А., и Гриффин, Дж. Х. (2013). Смещенный агонизм активируемого протеазой рецептора 1 активированным протеином C, вызванный неканоническим расщеплением по Arg46. Кровь 120, 5237–5246. DOI: 10.1182 / кровь-2012-08-452169

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пиала, Дж.-B., Cho, T.-H., Beuf, O., Joye, E., Moucharaffie, S., Langlois, J.-B., et al. (2007). МРТ-мониторинг очаговой церебральной ишемии у мышей с дефицитом рецепторов, активируемых пролифератором пероксисом (PPAR). ЯМР Биомед. 6, 335–342. DOI: 10.1002 / nbm.1157

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Премонт Р. Т., Гайнетдинов Р. Р. (2007). Физиологические роли G-протеин-связанных рецепторных киназ и аррестинов. Annu. Rev. Physiol. 69, 511–534.DOI: 10.1146 / annurev.physiol.69.022405.154731

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рамачандран Р. и Холленберг М. (2008). Протеиназы и передача сигналов: патофизиологические и терапевтические последствия через PAR и др. Br. J. Pharmacol. 153, 263–282. DOI: 10.1038 / sj.bjp.0707507

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рейтер, Э., Ан, С., Шукла, А. К., и Лефковиц, Р. Дж. (2012). Молекулярный механизм агонизма смещенного β-аррестина к семи трансмембранным рецепторам. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 52, 179–199. DOI: 10.1146 / annurev.pharmtox.010909.105800

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ревальд М. и Руф В. (2005). Передача сигналов рецептора-1, активируемого протеазой, активированным протеином С в эндотелиальных клетках, нарушенных цитокинами, отличается от передачи сигналов тромбина. J. Biol. Chem. 280, 19808–19814. DOI: 10.1074 / jbc.M500747200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рой, Р.В., Ардеширладжими, А., Динарванд, П., Янг, Л., и Резайе, А. Р. (2016). Заполнение EPCR человека протеином C индуцирует смещенную в отношении β-аррестина-2 передачу сигнала PAR1 как APC, так и тромбином. Кровь 128, 1884–1893. DOI: 10.1182 / кровь-2016-06-720581

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Савинкова И.Г., Горбачева Л.Р., Беспалова З.Д., Пинелис В.Г., Струкова С.М. (2014). Пептиды, аналогичные связанным лигандам, высвобождаемым активированным протеином С, проявляют нейрозащитные эффекты при эксайтотоксичности, вызванной глутаматом. Биохимия 8, 116–120. DOI: 10.1134 / S19813050176

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шрётер М., Джандер С. и Столл Г. (2002). Неинвазивная индукция фокальной церебральной ишемии у мышей путем фототромбоза корковых микрососудов: характеристика воспалительных реакций. J. Neurosci. Методы 117, 43–49. DOI: 10.1016 / S0165-0270 (02) 00072-9

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сох, У. Дж. К., Трехо, Дж.(2011). Активированный протеин C способствует передаче активируемого протеазой цитопротекторного сигнала рецептора-1 через β-аррестин и каркасы растрепанного-2. PNAS 108, 1372–1380. DOI: 10.1073 / pnas.1112482108

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сонг, М. К., Сон, Х. Дж., Ким, И. Г., Хан, Дж. Й., Чой, И. С., и Ли, С. Г. (2012). Эффект комбинированной терапии упражнений и ноотропных агентов на когнитивные функции в модели крыс с очаговым инфарктом головного мозга. Ann.Rehabil. Med. 36, 303–310. DOI: 10.5535 / arm.2012.36.3.303

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Суо З., Цитрон Б. А. и Фестофф Б. В. (2004). Тромбин: потенциальный провоспалительный медиатор при нейротравмах и нейродегенеративных расстройствах. Curr. Лекарство нацелено на воспаление. Аллергия 3, 105–114. DOI: 10.2174 / 1568010043483953

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Трайнелис, С. Ф., Трехо, Дж.(2007). Передача сигналов рецептора, активируемого протеазой: новые роли и регуляторные механизмы. Curr. Opin. Гематол. 14, 230–235. DOI: 10.1097 / MOH.0b013e3280dce568

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ву, Т.-К. Х., Хунг, Д. Т., Уитон, В. И., и Кофлин, С. Р. (1991). Молекулярное клонирование функционального рецептора тромбина раскрывает новый протеолитический механизм активации рецептора. Cell 64, 1057–1068. DOI: 10.1016 / 0092-8674 (91)

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, Х., Убл, Дж. Дж., И Райзер, Г. (2002). Четыре подтипа рецепторов, активируемых протеазой, совместно экспрессируемых в астроцитах крыс, вызывают различные физиологические сигналы. Glia 37, 53–63. DOI: 10.1002 / glia.10012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Си, Г., Райзер, Г., и Кипр, Р. Ф. (2003). Роль тромбина и рецепторов тромбина в ишемическом, геморрагическом и черепно-мозговом повреждении: вредное или защитное? J. Neurochem. 84, 3–9. DOI: 10.1046 / j.1471-4159.2003.01268.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Злокович Б. В., Гриффин Дж. Х. (2011). Цитопротективные пути протеина С и его последствия для инсульта и неврологических расстройств. Trends Neurosci. 34, 198–209. DOI: 10.1016 / j.tins.2011.01.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Особенности и возможности экстренной лапароскопии при остром нетравматическом животе.

Оригинальная статья

J IMAB . Октябрь-декабрь 2019 г .; 25 (4): 2843-2846;
ОСОБЕННОСТИ И ВОЗМОЖНОСТИ НЕОТЛОЖНОЙ ЛАПАРОСКОПИИ ПРИ ОСТРОМ НЕТРАВМАТИЧЕСКОМ ЖУРНАЛЕ
Константин Костов ,
Кафедра общей, висцеральной и неотложной хирургии Университета им.И. Пирогов »- София, Болгария.

РЕФЕРАТ:
Цель : Целью данного исследования является анализ роли экстренной лапароскопии в диагностике пациентов с острой абдоминальной болью в анамнезе, когда физикальное обследование и диагностические тесты не позволяют выявить неотложную ситуацию. случаи. Также важно продемонстрировать клинические показания и результаты неотложной лапароскопической операции при острых заболеваниях брюшной полости.
Материалы и методы : Всего 756 пациентов с диагнозом «острый нетравматический живот» были госпитализированы сроком на два года с 1.С 1.2014 по 1.1.2016 в отделении общей, висцеральной и неотложной хирургии УМХАТЕМ «Пирогов». Из них женщин было 402 (53,17%), мужчин — 354 (46,83%). Возраст в данном ретроспективном анализе варьировал от 18 до 79 лет (в среднем 51,3).
Результаты : Пациенты разделены на 3 группы по подозрению на диагноз.
Операции на остром животе в I группе (711 пациентов, 94,05%) включают воспалительные заболевания — острый холецистит, острый аппендицит, разрыв кисты яичника и острый панкреатит.Диагностическая точность лапароскопии составила 100%.
Лапароскопически прооперированы 26 пациентов (3,44%) с перфорацией брюшной полости (группа II). Диагностическая точность лапароскопии также составила 100%.
Из 19 оперированных пациентов (2,51%) по поводу острой кишечной непроходимости и брыжеечной ишемии (III группа) женщин было 7, мужчин 12. Диагностическая точность лапароскопии составила 100%. Выводы : Лапароскопия позволила поставить диагноз большому количеству пациентов. Это очень хороший диагностический и лечебный инструмент.Это должно быть хирургическое обследование первой линии при невыявленной боли в животе без какой-либо специфической этиологии.

Ключевые слова : острый нетравматический живот, перитонит, доступ, традиционная хирургия, лапароскопия,

— Скачать ПОЛНЫЙ ТЕКСТ / PDF 501 KB /
Цитируйте эту статью как: Костов К. Особенности и возможности экстренной лапароскопии при остром нетравматическом животе. Дж IMAB. , октябрь-декабрь 2019 г .; 25 (4): 2843-2846.
DOI: 10.5272 / jimab.2019254.2843

Для корреспонденции: Костов Константин, кандидат медицинских наук; 3-я хирургическая клиника, УМХАТЕМ «Н. И. Пирогов »; 21, бул. Тотлебен, 1606 София, Болгария; Электронная почта: [email protected]

ССЫЛКИ:
1. Sheridan WG, White AT, Havard T, Crosby DL. Неспецифическая боль в животе: последствия для ресурсов. Ann R Coll Surg Engl. 1992 Май; 74 (3): 181-5. [PubMed]
2. Лайтдейл CJ. Лапароскопия в век визуализации. GastrointestEndosc. 1985 Февраля; 31 (1): 47-48.
3. Вандер Велпен Г.К., Шими С.М., Кушьери А. Диагностические возможности и преимущества лапароскопии для лечения: проспективный аудит. Gut. 1994 Nov; 35 (11): 1617-21. [PubMed] [Crossref]
4. Пааянен Х., Юлкунен К., Варис Х. Лапароскопия при хронической боли в животе: проспективное нерандомизированное долгосрочное исследование. J Clin Gastroenterol. 2005 Feb; 39 (2): 110-4. [PubMed]
5. Ондерс Р.П., Миттендорф Э.А. Полезность лапароскопии при хронической боли в животе. Хирургия. 2003 Oct; 134 (4): 549-52. [PubMed] [Crossref]
6. Навез Б., Навез Дж. Лапароскопия в остром животе. Лучший Практик Рес Клин Гастроэнтерол . 2014 Фев; 28 (1): 3-17 [PubMed] [Crossref]
7. Самсонов В.Т., Ермолов А.С., Гуляев А.А., Ярцев П.А., Левицкий В.Д., Рогаль М.М. Лапароскопия в экстренной абдоминальной хирургии. Хирургия (Моск). 2019; (9): 32-37. [PubMed]
8. Гупта П., Раджапандиан С., Сабнис С.К., Паланивелу С. Лапароскопическое лечение необычного случая непроходимости тонкой кишки: аппендикулоилеального узла. BMJ Case Rep . 2018 23 июля; 2018. pii: bcr-2018-224640. [PubMed] [Crossref]
9. Атанасов Т., Врачанский Д., Филипов А., Раденовски Д. Лапароскопический доступ к непроходимости тонкой кишки. Журнал экстренной медицины . 2009 16 (1): 4-11
10. Атанасов Т. Лапароскопическая аппендэктомия с одним разрезом: операция без рубца через пуповину. Журнал неотложной медицины . 2009 16 (2): 23-29
11. Saeian K и Reddy KR. Диагностическая лапароскопия: Эндоскопия 1999 января; 31 (1): 103-9.[PubMed]
12. Бойд В.П. Младший, Норд Х.Дж. Диагностическая лапароскопия: Эндоскопия 2000 фев; 3 (2): 153-8. [PubMed]
13. Маевски В. Диагностическая лапароскопия острого живота и травм: SurgEndlosc 2000 Oct; 14 (10): 930-37. [PubMed]
14. Карнам США и Редди КР. Диагностическая лапароскопия — обновление: Энкдоскопия 2002 февраль; 34 (2): 146-53. [PubMed]
15. Reinmann JF. Диагностическая лапароскопия: Endoscopy 2003 Jan; 35 (1): 43-7. [PubMed]
16. Flum DR, Koepsell T.Клинические и экономические корреляты неправильно диагностированного аппендицита: общенациональный анализ. Arch Surg Июль 2002; 137 (7): 799-804. [PubMed]
17. Надь А., Джеймс Д. Диагностическая лапароскопия. Am J Surg 1989 Май; 157 (5): 490-3. [PubMed]
18. Хакенберг Т.П., Ментула А, Леппаниеми В. Саллинен. Сравнение лапароскопических и открытых операций по поводу острой спаечной непроходимости тонкой кишки: анализ по шкале предрасположенности. Скандинавский J Surg . 2017 Март; 106 (1): 28-33. [PubMed]
19.Sjövall S, Kokki M, Kokki H. Лапароскопическая хирургия: повествовательный обзор фармакотерапии при лечении боли. Наркотики . 2015 ноя; 75 (16): 1867-89. [PubMed]
20. Маюми Т. Основные моменты темы «Практические рекомендации по первичной медицинской помощи при остром животе 2015». J Гепатобилиарная поджелудочная железа Sci . 2016; 23 (1): 1-2.
21. Маюми Т., Йошида М., Тадзума С., Фурукава А., Нишии О., Шигемацу К. и др. Практическое руководство по первичной медицинской помощи при остром животе, 2015 г. Jpn J Radiol. 2016 Янв; 34 (1): 80-115. [PubMed]
22. Lee C, Kao L, Lin H, Wei P. Сравнение клинических результатов лапароскопической и открытой правой гемиколэктомии: общенациональное исследование. Мир J Surg Oncol . 2015 августа 15; 13: 250 [PubMed]

Поступила: 18 марта 2019 г.
Опубликована онлайн: 16 декабря 2019 г.

вернуться в онлайн-журнал