Фибробласты полиплоиды: Фибробласты полиплоидные. Фибробласты в косметологии. Омоложение фибробластами останавливает процесс старения

Содержание

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

4 фактора (Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2) на основе протокола трансдифференцировка, представленный здесь предлагает надежный метод для создания точно конвертирована iTSCs из эмбриональных фибробластов мыши. Кроме того, способ также применим для послеродовых хвостовых фибробласты, хотя и с падением эффективности по сравнению с эмбриональными фибробластами 3. В целом, качество первичных фибробластов является решающим фактором исхода и ухода трансдифференцировку должны быть приняты, чтобы использовать ранние прохождение клеток (пассаж от двух до трех).

Сила этого протокола является использование доксициклина-индуцируемых векторы, которые допускают временной контроль экспрессии трансгена. Это дает возможность генерации стабильных линий ITSC, которые активируют эндогенный фактор транскрипции сети, поддерживая TSC судьбу независимо от экспрессии трансгенов. Это в отличие от ранее опубликованных протоколов, описывающих индукцию TSC судьбы из эмбриональных стволовых клеток, метод тхат на сегодняшний день только дает неполностью перепрограммирован трофобласт стволовых клеток , как клетки 1.

Тем не менее, известное ограничение протокола, описанного здесь является переменное число новых transdifferentiated колоний, что делает его трудно предсказать эффективность трансдифференцировку. Эти ограничения обусловлены несколькими сильно изменчивых факторов, которые имеют решающее значение для исхода трансдифференцировку: эффективность трансдукции отдельных лентивирусов векторов, количество пролиферации исходного клеточной популяции, а количество клеточной гибели во время трансдифференцировки. При некоторых обстоятельствах transdifferentiated ITSC колонии не появляются. В этом случае средства массовой информации и реагенты должны быть проверены на их способности поддерживать подлинную культуру TSC, перед их использованием в производстве ITSC. Кроме того, трансдукция с 4F можно титровать, так как слишком больших количеств трансгенной экспрессии приводят к гибели клеток. В общем, к югу от культивированием отдельных ITSC лИнес требует некоторой практики. В случае, когда возникают трудности с субкультуры iTSCs (то есть. , Субкультивироваться клетки неспособны поддерживать самообновление и вместо того, чтобы спонтанно дифференцироваться), одиночные изолированные колонии могут быть альтернативно высевали на чашки с 50% плотности клеток роста инактивированной фидера клетки для поддержания роста и присоединение клеток. Линии ITSC можно затем постепенно отучить от кормушек во время последующего пассирования. Следует отметить, что нам не удалось непосредственно конвертирование MEFs в iTSCs с использованием определенных условий TX средних, поскольку TX среда поддерживает только установлены ITSC / TSC линии.

До сих пор протокол ITSC индукции из фибробластов устанавливается только для мышиных клеток. Следовательно, теперь он будет представлять большой интерес адаптировать этот протокол к другим видам и включить вывод ITSC линий от модельных систем человека или других. Кроме того, анализ точных механизмов фибробласте конверсии ITSC будет предлагать новые знания о природесоматического по сравнению с экстра-эмбриональных барьера клонального и помощи в понимании принципов определения судьбы клеток во время нормального и патологического развития.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Полиплоидия.

Причины возникновения:

  1. неравное расхождение хромосом к полюсам в анафазе

  2. деление ядра без деления клетки

  3. удвоение хромосом без их отделения друг от друга

Организмы, у которых произошло умножение целых гаплоидных наборов, называются полиплоидами или эуплоидами.

Полиплоиды, у которых число хромосом не является кратным гаплоидному набору, называются гетероплоидными или анеуплоидными.

Полиплоидизация может также возникать в части клеток в резулбтате нарушения митоза – это соматическая полиплоидия.

Автополиплоидия – полиплоидия, возникающая на основе увеличения числа хромосом внутри рода.

Молекулярные механизмы и биологическая роль репарации ДНК.

Устойчивость всех живых организмов к различным повреждающим агентам (физической, химической и биологической природы) определяется их способностью к восстановлению поврежденных структур. Особая роль принадлежит процессу репарации ДНК на молекулярном уровне, которое приводит к восстановлению нормальной структуры нуклеиновых кислот.

Роль ДНК и РНК (САМОСТОЯТЕЛЬНО!!!!)

В ходе эволюции возникли восстановительные системы, которые направлены на исправление повреждений в молекуле ДНК.

В настоящее время выделяют:

Дорепликативная репарация –

  • фотореактивация,

  • эксцезионная или темновая репарация.

Фотореактивация – это явление открыто в 1949 году Кёльнером.

Фотореактивация относится к одноэтапным процессам и осуществляется с помощью фермента – фотолиаза. Сущность этого явления состоит в том, что видимый свет (λ = 300-400 нм) возбуждает фотореактивирующий фермент (ФРФ), который в свою очередь расщепляет пиримидиновые димеры.

Этот механизм устраняет только один вид повреждения (тиминовые димеры) осуществляется одним ферментом в одну стадию. В темноте фотолиаза присоединяется к димеру и под действием видимого света расщепляет димер с образованием исходных неповрежденных оснований, а фотолиаза высвобождается.

В 1971 году было установлено, что ФРФ обнаружен у всех видов живых организмов; фотореактивация была выявлена в лейкоцитах и фибробластах.

Необходимо отметить, что связывание фермента с содержащей димеры ДНК обратимо. Если этот комплекс не подвергается действию фотореактивирующего света, то происходит его диссоциация, а ДНК, которая несет измененные фрагменты может стать субстратом для действия ферментов темновой репарации.

Биологическая роль фотореактивации состоит в защите ДНК от УФ излучения.

Эксцезионная репарация. Темновая репарация и внеплановый синтез днк.

Наиболее общим способом исправления структур поврежденной ДНК является эксцезионнная репарация.

Механизм эксцезионной репарации был обнаружен в 1964 г. в клетках микроорганизмов, облученных УФ светом. Характерной особенностью была эксцезия (вырезание пиримидиновых димеров из УФ облученных ДНК).

Позднее оказалось, что этот механизм не ограничивается устранением УФ повреждений ДНК, а имеет универсальное значение системы элиминирующей любые химические повреждения первичной структуры ДНК.

Другой особенностью эксцезионной репарации является отсутствие потребности в энергии видимого или ближнего УФ света.

Эксцезионная репарация относится к многоэтапным процессам, происходит в 4 стадии с помощью мультиферментной системой и устраняет димеры, пиримидиновые основания и продукты радиолиза.

Стадии:

  • инцезия (надрезание) – это ферментативный процесс, заключающийся в разрыве эндонуклеазами цепи ДНК рядом с повреждением. Считают, что этой стадии предшествует стадия распознавания дефектов ДНК.

  • эксцезия – в ходе которой происходит выщепление димера и стоящих рядом нуклеотидов участвует фермент экзонуклеаза. Эксцезия начинается экзонуклеазной атакой поврежденной ДНК. При этом отщепляется пиримидиновый димер и происходит дальнейшее последовательное отщепление стоящих рядом нуклеотидов. Другой конец разрыва, содержащий на 3

    / — конце фосфатную группу, не может служить затравкой для экзонуклеазной активности ДНК – полимеразы 1, т.к. активность фермента, присоединяющегося к такому концу ингибируется, поэтому отщепление фосфата с 3/ — конца вместе с нуклеотидом происходит под действием фермента эндонуклеазы 3. В результате образующийся 5/ — конец является необходимым для завершения стадии репарации ДНК или ДНК – полимеразной реакции или для завершения репаративного синтеза. В качестве матрицы для репаративного синтеза ДНК используется комплементарная неповрежденная нить ДНК, которая обеспечивает точное воспроизведение первичной структуры ДНК, которая существует до воздействия мутагена.

  • репаративный синтез, при котором образуются бреши, которые застраиваются короткими участками с помощью фермента ДНК – полимеразы.

  • стадия сшивания — сшивание 5/ — конца с 3/ — концом репарированной ДНК, участвует фермент лигаза. При действии радиации, когда происходит разрыв ДНК, лигаза может действовать как самостоятельный репаративный фермент, осуществляет сверхбыструю репарацию.

Т.о. фотореактивация и эксцезионная репарация протекает до того как поврежденные клетки вступят в фазу синтеза ДНК.

В отличии от фотореактивации и эксцезионной репарации пострепликативная репарация начинается после того как клетки приступают к репликации.

При этом синтез ДНК идет в обход повреждения, но против них в дочерних нитях образуются бреши, которые заделываются путем рекомбинации или синтезом ДНК de novo.

Синтез ДНК de novo может быть двоякого рода:

  • синтез аналогичный нормальной репликации, при которой азотистые основания включаются в ДНК в полном соответствии с правилами комплиментарности – это называется безошибочный путь репарации

  • безматричный синтез, когда основания встраиваются наугад (склонный к ошибкам путь восстановления)

Все 3 типа репарации широко распространены в природе. У разных групп организмов тот или иной путь репарации может быть более активным или даже отсутствовать полностью, тогда это компенсируется другими репарирующими системами. Совместное действие разных восстановительных систем устраняет многие повреждения ДНК.

Это разнообразие дает основание предполагать, что репарации подвергаются любые стабильные изменения НК. Показано, что с помощью репарации можно избежать некоторые мутации, которые приводят к летальному исходу, злокачественным новообразованиям и т.д.

болезни

Репарационные последствия при некоторых наследственных болезнях человека.

В настоящее время ряд наследственных заболеваний человека изучается в связи с репарационными процессами. 5 заболеваний – это заболевания аутосомно – рецессивного типа разных по клинической картине, но их общей чертой является нестабильность хромосом, иммунологическая недостаточность, повышенный риск заболевания раком.

Пигментная ксеродерма – клиническое название объединяет целую группу болезней, при которых наблюдается повышенная чувствительность кожи к солнечному свету.

Клинические признаки: покраснение кожи, пигментные пятна в дальнейшем появляются злокачественные новообразования, признаки старения кожи.

Пигментная ксеродерма первое заболевание, для которого была прослежена взаимосвязь между заболеванием и репаративными процессами.

Фибробласты кожи больных оказываются более чувствительны к УФ облучению. Это связано с тем, что фибробласты обладают пониженной способностью выщеплять димеры тимина после УФ облучения.

При этом заболевании обнаруживается мутация в гене, которая отвечает за синтез УФ – специфичной эндонуклеазы.

Анемия Фанкони – поражены все ростки костного мозга. Наблюдается лейкопения, Т – цитопения, анемия, интенсивная коричневая пигментация кожи, дефекты развития скелета, почек, сердца и гонад.

Молекулярная причина: нарушение синтеза экзонуклеаз, завершающих вырезание поврежденного участка ДНК.

Приводит к лейкозу.

Атаксия (синдром Луи — Барр) – нарушен репаративный синтез. Основные проявления: прогрессирующая атаксия мозжечка, нарушение координации движений, рецидивирующая пневмония с развитием брорнхо – эктопического болезни, гипоплазия тимуса, дисгаммаглобулинемия.

Осложненный неврологический симптом, случаи опухолевого роста лимфатической ткани наблюдается как у гомо- так и у гетерозиготных носителей.

Для клеточной патологии характерна высокая частота спонтанных разрывов хромосом. В периферической крови лимфоциты 7,5% хромосом имеют разрыв.

При оберации хромосом одино….?????????????????????????

Механизм: отсутствие специфической эндонуклеазы.

52

Патолого-анатомическое отделение / Структура института / Институт / Главная

Патолого-анатомическое отделение:

Патолого-анатомическое отделение было создано в 2016 году путем реорганизации лаборатории патоморфологии, созданной в 2006 году.

Цель и задачи патолого-анатомического отделения

Ведение научной работы по вопросам этиологии, патогенеза, разработка новых подходов в морфологической диагностике заболеваний человека. Внедрение  в  практику  современных  иммуногистохимических и молекулярно-биологических технологий, направленных на  совершенствование морфологической верификации заболеваний человека.

Структура отделения

1. Гистологическая лаборатория

2. Иммуногистохимическая лаборатория

3. Лаборатория молекулярно-биологических исследований

4. Референс-лаборатория

5. Лаборатория телепатологии

Совместно с Российским обществом патологоанатомов и при поддержке Министерства здравоохранения Свердловской области на базе отделения осуществляется деятельность в статусе референс-лаборатории по программе HER2 тестирования рака молочной железы по Уральскому федеральному округу.

Заведующий отделением

Сазонов Сергей Владимирович

Доктор медицинских наук, профессор
Врач высшей квалификационной категории
Автор 480 научных работ, 5 методических пособий для врачей, 2 новых медицинских технологий, 37 патентов. 
Под руководством проф. Сазонова С.В. защищено 7 кандидатских диссертаций, в настоящее время выполняется 4 диссертационных исследования.

Сотрудники патолого-анатомического отделения:

Демидов С.М. – ведущий  научный сотрудник, доктор медицинских наук

Быстрова Е.В. – старший научный сотрудник

Конышев К.В. – врач-патологоанатом, кандидат медицинских наук

Зайцева Л.Н. – врач-патологоанатом, кандидат медицинских наук

Казанцева Н.В. – врач-патологоанатом

Гребенюк Е. В. — младший научный сотрудник

Голотюк М.А. – биолог

Соломонова Н.В. – лаборант

Мельникова Т.М. – лаборант-исследователь

Основные направления и краткое содержание научной деятельности подразделения:

1. Изучение состояния регенераторных процессов в органах, пораженных патологическим процессом.

2. Изучение ангиогенеза в зависимости от степени дифференцировки и пролиферации клеток карциномы молочной железы.

3. Молекулярно-генетические исследования амплификации мутантного HER2 гена в опухолевых клетках с использованием многоцветной FISH (гибридизации insitu).

4. Молекулярно-генетические исследования амплификации мутантного TOP2a гена в опухолевых клетках карциномы молочной железы с использованием многоцветной FISH (гибридизации insitu).

5. Изучение влияния углеродных нанотрубок на регенерацию периферических нервов в экспериментальной модели.

6. Изучение изменений рецепторного аппарата клеток при раке предстательной железы.

7. Изучение адгезии межклеточных контактов при раке молочной железы и их прогностическое значение.

8. Изучение изменений рецепторного аппарата опухолевых клеток в первичном и метастатическом очаге.

9. Изучение особенностей экспрессии регуляторного белка p53, Topoisomerase 2a, Betya-Tubulin III, BRCA 1 при узловых предраковых заболеваниям молочной железы.

Основные результаты деятельности патолого-анатомического отделения:

Всего опубликовано 425 научных работ, 5 методических пособия для врачей, получено 37 патентов.

Патолого-анатомическое отделение подтвердило статус референс-лаборатории на территории Уральского федерального округа на 2016 г.

КОНСЕНСУС СОВЕТА ЭКСПЕРТОВ ПО ДИАГНОСТИКЕ РМЖ (11 октября 2015 года, Москва)

Сертификат независимой организации контроля качества NordiQС 

Сертификат соответствия деятельности Патолого-анатомического отделения по ИГХ-исследованиям международным стандартам

Сертификат независимой организации контроля качества NordiQС (методом BRISH)

Европейский Сертификат соответствия качества проводимых молекулярно-биологических исследований (методом BRISH)

Основные публикации за 2018 г.

1. Сазонов С.В., Бриллиант А.А., Бриллиант Ю.М.  Связь состояния пролиферативных процессов и особенностей рецепторного аппарата опухолевых клеток карциномы молочной железы. Гены и клетки, 2017, Т.XII. №4. С.76-82. Журнал входит в базы РИНЦ (ИФ=0,29), Scopus

2. Баженов И.В., Филиппова Е.С., Базарный В.В., Сазонов С.В., Волкова Л.И., Зайцева Л.Н.  Чувствительность и специфичность нейротрофинов мочи и сыворотки крови в диагностике нейрогенной гиперактивности детрузора при рассеянном склерозе. Урология, 2018, №3, С. 44-48. Журнал входит в базы РИНЦ, Scopusи WebofScience/ИФ- РИНЦ = 0,625

3. Фадеев Ф.А.,Хрунык Ю.Я., Беликов С.В., Луговец Д.В., Губаева О.В., Сазонов С.В., Корелин А.В., Леонтьев С.Л.  Сравнительная характеристика пролиферативной и секреторной активности фибробластов на анодированной и необработанной поверхности титановых имплантатов. Геныиклетки, 2018, Т.XII. №1. ПриложениеС.103-104.

4. Kazantseva N., Brilliant F., Brilliant Y., Sazonov S. The level of proliferation in cases of breast cancer with high and low maintenance of cancer stem cells. European Journal of Patology (VirchowsArchiv), 2018: 473 (1), S. 205. ЖурналвходитвбазыРИНЦ, Scopusи WebofScience/Импакт-факторScopus — 2, 936.

5. Konyshev K., Sazonov S. Correlation of changes of estrogen receptor and progesterone receptor expression levels in locoregional metastases of breast cancer comparing with primary tumor. European Journal of Patology (VirchowsArchiv), 2018: 473 (1), S. 50. ЖурналвходитвбазыРИНЦ, Scopus и  Web of Science/Импакт-фактор Scopus — 2, 936.

6. BrilliantA., Brilliant Y., Sazonov S. Signalling pathways WNT, Hedgehog and Notch in  breast cancer with presence and absence of cancer stem cells. Postgraduate Medical Journal, 2018, 3 (Suppl 2), A126. ЖурналвходитвбазыРИНЦ, Scopusи WebofScience/ Импакт-факторScopus — 2, 078. 

7. Конышев К.В., Сазонов С.В.  Исследование HER2/NEU-статуса клеток рака молочной железы при регионарном метастазировании в случаях с неопределенным (2+) уровнем экспрессии HER2/NEU в ткани первичной опухоли.   Вестник уральской медицинской академической науки. 2018, 15 (1),  48–54. Журнал входит в базы РИНЦ, ИФ 0,156

8. Vinogradov A.V., Sazonov S.V.,  Sergeev A.G. Clinical and Pathological Features DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 and WT1 Genes Mutations Detection in Acute Myeloid Leukemia Patients Aged 15-45 Years Old. Haematopoiesisimmunology, 2018, №1 Т.16. C. 151-154. ИФРИНЦ=0.12

9. Виноградов А.В., Изотов Д.В., Резайкин А.В., Сазонов С.В., Сергеев А.Г., Леонтьев С.Л. Молекулярное моделирование мутантных форм FLT3 при острых миелоидных лейкозах больных молодого и пожилого возраста с использованиемраспределенной сети предсказания структуры белка.  Вестник уральской медицинской академической науки. 2018, Том 15, №3, с. 384

392, Журнал входит в базы РИНЦ, ИФ 0,156.

10. Бриллиант А.А., Бриллиант Ю.М., Сазонов С.В. Особенности величины пула ALDh2 + опухолевых стволовых клеток в иммуногистохимических подтипах инвазивного рака молочной железы.  Вестник уральской медицинской академической науки. 2018, Том 15, №3, с. 413-420. Журнал входит в базы РИНЦ, ИФ 0,156

11. Сазонов С.В. Основные итоги реализации проекта Российского общества патологоанатомов по обеспечению качества молекулярно-генетической диагностики рака молочной железы в Уральском федеральном округе Российской Федерации. Вестник уральской медицинской академической науки. 2018, Том 15, №4, с. 594-606. Журнал входит в базы РИНЦ, ИФ 0,156

Участие в конференциях в 2018 г.

1. Expression of WHT, Notch, Hedgehog molecules in cancer stem cells-positive cases  of breast cancer The 11 European Breast Cancer Conferene, 21-23 March 2018, Barcelona, Spain.

2. CLINICAL AND PATHOLOGICAL FEATURES DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 AND WT1 GENES MUTATIONS DETECTION IN ACUTE MYELOID LEUKEMIA PATIENTS AGED 15-45 YEARS OLD. 15 th International Scientific Conference “Haematopoiesis immunology” Budapest, 5-7 June 2018

3.  Корреляция различий уровней экспрессии рецепторов к эстрогену и рецепторов к прогестерону в ткани первичной опухоли и регионарных метастазов рака молочной железы. IYПетербургскийМеждународныйонкологическийфорум «Белыеночи», 5-8 июля, 2018 г.

4. The level of proliferation in cases of breast cancer with high and low maintenance of cancer stem cells. 30 European Congress of  Pathology, Bilbao, Spain,  8-12 September 2018

5.  Correlation of changes of estrogen receptor and progesterone receptor expression levels in locoregional metastases of breast cancer comparing with primary tumor.  30 European Congress of  Pathology, Bilbao, Spain,  8-12 September 2018

6. Signalling pathways WNT, Hedgehog and Notch in  breast cancer with presence and absence of cancer stem cells. 25 th Biennial Congress of the European Association for Cancer Research, Amsterdam, TheNetherlands, 30 June-3 July 2018, A126 

7. Цифровые технологии в образовательном процессе на кафедре гистологии. Конгресс МАМ. Астрахань, 19-23 сентября 2018 г.

8. Взаимосвязь изменений уровней экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона при регионарном метастазировании рака молочной железы. Конгресс МАМ. Астрахань, 19-23 сентября 2018 г.

9. Связь изменений уровней экспрессии  HER2/neu и рецепторов к эстрогену при регионарном метастазировании рака молочной железы с неопределенным (2+) уровнем экспрессии HER2/neu в клетках первичной опухоли. Научная конференция с международным участием «Актуальные вопросы морфогенеза в номе и патологии», Москва, ИМЧ, 2018.

 10. Конышев К.В., Сазонов С.В.  Изменения экспрессии онкобелка HER2/neu и рецепторов к эстрогену в опухолевых клетках при регионарном метастазировании рака молочной железы с неопределенным уровнем экспрессии HER2/neu в клетках первичной опухоли. Всероссийская конференция по молекулярной онкологии, 17-19 декабря 2018 г., Москва

11. Бриллиант А.А., Бриллиант Ю.М., Сазонов С.В. Активация сигнальных путей Wnt, HedgehogиNotch в иммуногистохимических подтипах рака молочной железы с высоким и низким содержанием опухолевых стволовых клеток. Всероссийская конференция по молекулярной онкологии, 17-19 декабря 2018 г. , Москва

12.  Сазонов С.В., Казанцева Н.В.,Конышев К.В., Денисенко С.А. Проявления эпителиально-мезенхимального перехода при трижды негативном раке молочной железы. Всероссийская конференция по молекулярной онкологии, 17-19 декабря 2018 г., Москва

13. Быстрова Е.В., Бриллиант А.А., Сазонов С.В., Демидов С.М. Взаимосвязь экспрессии Тор2а и HER2 в клетках карциномы молочной железы. Всероссийская конференция по молекулярной онкологии, 17-19 декабря 2018 г., Москва

14. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Пирожкова В.М., Сазонов С.В., А.Г.Сергеев. Динамика молекулярно-генетических изменений при остром миелобластном лейкозе, резистентном к программной химиотерапии. Всероссийская конференция по молекулярной онкологии, 17-19 декабря 2018 г., Москва

15. Сазонов С.В., Бриллиант А.А., Бриллинат Ю.М., Фадеев Ф.А., Демидов С.М. Опыт культивирования клеток карциномы молочной железы люминального подтипа.  7 Межрегиональная научно-практическая конференция: Клеточные технологии – практическому здравоохранению, 6 декабря, 2018, г. Екатеринбург,

16. Конышев К.В., Сазонов С.В.  Рецепторный статус клеток рака молочной железы изменяется при регионарном метастазировании. 7 Межрегиональная научно-практическая конференция: Клеточные технологии – практическому здравоохранению, 6 декабря, 2018, г. Екатеринбург,

17. Конышев К.В., Сазонов С.В. Связь изменений уровней экспрессии HER2/neu и рецепторов к эстрогену при регионарном метастазировании рака молочной железы с неопределенным (2+) уровнем экспрессии HER2/neu в клетках первичной опухоли. Научная конференция с международным участием «Актуальные вопросы морфогенеза в номе и патологии», Москва, 2018

Монографии

Сазонов С.В. Обеспечение качества молекулярно-биологических исследований при диагностике рака молочной железы / под ред. проф. ЛеонтьеваС.Л. Екатеринбург, ВУМАН, 2018 — 194 с. Sazonov S.V. Ensuring the quality of molecular biological studies in the diagnosis of breast cancer / Ekaterinburg, VUMAN, 2018 — 194 p.

Патенты за 2018 г.

1. Патент на промышленный образец № 110353 от 15 августа 2018 г. «Схема механизмов изменения рецепторного аппарата клеток карциномы молочной железы при регионарном метастазировании», Конышев К.В., Сазонов С.В.

2.  Патент на промышленный образец № 110339 от 14 августа 2018 г. «Схема демонстрации препарата «Развитие кости на месте хряща» посредством цифровой гистологии» Сазонов С.В., Конышев К.В.

3. Патент на промышленный образец № 110808 от 11 сентября 2018 г. «Схема связи экспрессии белка Р53 и особенностей рецепторного аппарата клеток рака молочной железы в различных иммуногистохимических подтипах», Бриллиант А.А., Сазонов С.В.

 4. Патент на промышленный образец № 103931 от 21 июня 2017 г. «Схема этапов проведения молекулярно-биологических исследований рака молочной железы», Сазонов С.В.Конышев К.В.

5. Патент на промышленный образец № 107766 от 10 апреля 2018 г. «Схема распределения уровня экспрессии фермента топоизомеразы 2 альфа при различном рецепторном статусе рака молочной железы», Сазонов С. В., Быстрова Е.В., Новикова Е.А.

Пособия для врачей, руководства

Семиглазов В.Ф., Палтуев Р.М., Манихас А.Г., Горбунова В.А., Орлова Р.В., Артамонова Е.В., Бесова Н.С., ПожарисскийК.М., Кудайбергенова А.Г., Гриневич В.Н., Савёлов Н.А., Сазонов С.В., ВысоцкаяИ.В., Летягин В.П., Черенков В.Г.,Лактивонов К.П., Бубликов И.Д., Корытова Л.И., Маслюкова Е.А., Семиглазова Т.Ю., Карахан В.Б., Половников Е.С., БеловД.М., Насхлеташвили Д.Р., Дашян Г.А., Параконная А.А., Апанасевич В.И., Семиглазов В.В., Евсеева Е.В., Бусько Е.А.,Захарова Н.А., Манихас Г.М., Портной С.М., Любченко Л.Н., Закиряходжаев А.Д., Ермощенкова М.В., Трофимова О.П.,Криворотько П.В., Шинкарев С.А., Зернов К.Ю., Исмагилов А.Х., Манзюк Л.В., Петровский С.Г., Новиков С.Н., Семенова

А.И., Проценко С.А., Константинова М.М., Латипова Д.Х. Клинические рекомендации РООМ 2018 г. по диагностике и лечению рака молочной железы (второе издание). Изд-во: ИД «ФБВ-пресс», Санкт-Петербург, 2018, 456 с. Тираж: 500 экз. ISBN 978-5-903018-66-6

Подготовка научных кадров

16 мая 2018 г. врач патологоанатом патолого-анатомического отделения Конышев Константин Вячеславович успешно защитил кандидатскую диссертацию по теме: «Изменение рецепторного аппарата клеток карциномы молочной железы прирегионарном метастазировании» на соискание ученой степени кандидата медицинских наук в диссертационном совете Д208.066.04 на базе ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» по специальности 03.03.04 –Клеточная биология, цитология, гистология.

Научный руководитель: Сазонов Сергей Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, заместитель главного врача понауке Института медицинских клеточных технологий.

Выдан диплом ВАК Приказом Министерства образования инауки Российской Федерации № 306/НК от 27 ноября 2018 г.

Общественное признание

1.  Диплом I степени Конкурс «Ученые УГМУ здравоохранению Урала» Секция: лучшее научное издание авторы:Сазонов С. В., Леонтьев С.Л., Блинкова Н.Б. — монография.  «Полиплоидия гепатоцитов в регенерации печени при хроническом гепатите у пациентов из разных возрастных групп» ISBN 978-5-9908479-3-4 Апрель 2018

2. Диплом — Лучший стендовый доклад Сазонов С.В.  на мероприятии Конгресс Международной Ассоциации Морфологов, Астрахань, 2018.

3. Благодарственное письмо акад. РАН, проф. В.А.Ткачука Сазонову С.В. за работу на  III Конгресс  «Регенеративная медицина», Москва, МГУ, 2018

ПГТ-А — First Genetics

Эмбриологические аспекты преимплантационного генетического тестирования

Потенциально биопсия может быть выполнена на трех различных стадиях:

  1. полярные тельца (PB) при оплодотворении яйцеклетки,
  2. один или два бластомера эмбриона стадии расщепления (подразумевается под аббревиатурой PGS 1.0.),
  3. трофэктодерма на стадии бластоцисты (PGS 2.0., а с момента использовании концепции выявления мозаичных эмбрионов PGS 3. 0., PGDIS, 2016)

Кроме того, в литературе встречаются данные о попытках аспирировать небольшой объем бластокоэтической жидкости.

Все виды упомянутого ранее биоматериала потенциально могут быть проанализированы с использованием различных технологий. Однако:

  1. биопсия бластоцисты менее травматична, чем биопсия бластомеров на стадии расщепления, так как при этом жертвуется меньшая доля общей клеточной массы
  2. биопсия полярного тельца оказалась технически слишком сложной для выполнения в рутинной практике
  3. биопсия полярного тельца позволяет выявлять только анеуплоидии, возникшие в ходе мейоза
  4. биопсия бластомеров может давать большой процент ложных результатов ввиду потенциального наличия на этом этапе нескольких клонов клеток эмбриона (мозаицизма)
  5. витрификация эмбрионов на стадии бластоцисты позволяет иметь запас времени для исследования эмбрионов, а также подготовить эндометрий для переноса эуплоидного эмбриона.

Возможные методы для скрининга хромосомного статуса эмбриона

Хромосомный анализ используется в клинической практике с середины 90-х годов.

FISH флуоресцентная гибридизация

90-е годы

Первоначально эта диагностическая стратегия была выполнена с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), что заключалось в нанесении одной клетки эмбриона на стадии расщепления (бластомера) на предметное стекло и гибридизацию ее ДНК с хромосомно-специфическими флуоресцентными зондами. Ограниченное количество исследованных хромосомных зондов также означало, что некоторые анеуплоидии остались непроверенными, что привело к переносу необнаруженных анеуплоидных эмбрионов.

В середине 2000-х годов стало ясно, что эти недостатки и диагностическая ненадежность в сочетании с негативными последствиями биопсии на стадии расщепления ставят под угрозу клинические исходы пациентов, для которых проводили ПГТ-А, что вызвало необходимость появления более безопасной, надежной и точной стратегии.

CCS комплексный хромосомный скрининг

>98% точность, которую показали все платформы CCS

Впоследствии разработка технологий комплексного хромосомного скрининга (CCS), включая сравнительную геномную гибридизацию (aCGH), массивы однонуклеотидных полиморфизмов (массивы SNP) и количественную полимеразную цепную реакцию (qPCR), обеспечила значительное улучшение клинического применения ПГТ-А.


При тестировании, проведенном на одной клетке из клеточных линий фибробластов с известным кариотипом, все платформы CCS показали точность выше 98% для детекции полных анеуплоидий.

Все платформы, которые способны анализировать все 23 пары хромосом, имеют сравнимую эффективность в выявлении анеуплоидии целой хромосомы, но отличаются друг от друга

  1. по способности одновременно идентифицировать другие структурные хромосомные аномалии: сегментарные дупликации хромосом (dups) или делеции (dels)
  1. по возможности идентифицировать мозаицизм или количество копий митохондриальной ДНК

aCGH, SNP и массивное параллельное секвенирование (MPS, NGS) требуют первого шага амплификации всего генома (WGA, полногеномной амплификации).

FISH и qPCR не требуют предварительного этапа амплификации.

NGS обеспечивает более высокую точность при оценке субхромосомных аномалий (например, сегментарных анеуплоидий) по сравнению с предыдущими методами CCS.

Кроме того, NGS используется для обнаружения хромосомного мозаицизма (когда две кариотипически разные популяции клеток сосуществуют в одном и том же эмбрионе).
Однако важно, что обнаружение мозаицизма низкого и высокого уровня (например, 20 и 80%, соответственно) должно интерпретироваться с особой осторожностью, так как при таких значениях уровня мозаицизма довольно трудно отличить биологические находки от технических особенностей секвенирования данного конкретного образца. Этот момент чрезвычайно важен, особенно для пациентов, с ограниченным количеством эмбрионов.

Кроме того, некоторые диагностические платформы могут также одновременно тестировать хромосомные аберрации и мутации одного гена.

Существует два основных типа микрочипов, доступных для генетического тестирования. Это массивы однонуклеотидных полиморфизмов и сравнительная геномная гибридизация.


Для обеих платформ микрочипов клетки трофэктодермы должны быть лизированы и амплифицированы с помощью некоторого типа протокола амплификации ДНК, который обеспечивает охват всего генома. Как и в случае любого генетического теста, качество диагностического результата начинается с качества образца амплифицированной ДНК.

SNP микрочипы

SNP (однонуклеотидные полиморфизмы) — это пары одиночных нуклеотидов (A, T, C или G) в геномной ДНК, которые сильно варьируют в пределах данного вида. В контексте ПГТ-А оцениваемые SNP обычно находятся в некодирующих частях генома.

После WGA эмбриональная ДНК фрагментируется и гибридизуется с SNP микрочипом, который содержит зонды для более чем 300 000 различных SNP сайтов по всему геному.

После гибридизации выполняется этап удлинения цепи и окрашивания. A/T нуклеотиды на сайте SNP помечены с красным флуорохромом, а нуклеотиды G/C на сайте SNP помечены зеленым флуорохромом.

Измеряя интенсивность флуоресценции от красного к зеленому на каждом участке SNP в массиве, можно одновременно определить генотип более 300 000 SNP в каждом образце и сравнить полученные результаты с эталонным геномом карты человека.


Массивы полученных данных позволяют идентифицировать анеуплоидию всей хромосомы, а также могут идентифицировать приблизительно 250 общих структурных хромосомных аберраций по всему геному. 


Однако существуют сотни других структурных аномалий хромосом, которые ниже разрешения 300 000 массивов SNP, используемых для ПГТ-А, которые могут играть важную роль при имплантации, выкидышах или рождении ребенка с серьезным генетическим синдромом. Поскольку предоставляется информация о генотипе, эти массивы SNP имеют ограниченную способность идентифицировать триплоидию, но могут идентифицировать однородительские дисомии.  

SNP-микрочипы могут также идентифицировать мозаицизм, если проанализировано достаточное количество клеток трофэктодермы. Одним из ограничений SNP микрочипов, используемых для ПГТ-А, является неспособность их алгоритма идентифицировать число копий, когда муж и жена — кровные родственники. 

CGH микрочипы

Микрочипы CGH (aCGH) менее плотные, чем микрочипы SNP. Чипы aCGH, используемые для ПГТ-А, имеют приблизительно 4000 маркеров (которые прогоняются в дубле), расположенных по всему геному.

aCGH — это протокол выявления соотношений копийности клинического образца и референсного генома женского или мужского пола. Анализ может быть проведен в более короткие сроки по сравнению с SNP (за 12–15 часов).

Это является значительным преимуществом перед SNP микрочиповым исследованием, проведение которого требует около 30-40 часов. Генотипы, которые идентифицируются в SNP, в данном типе анализе не выявляются, а значит, aCGH не может различать кариотип 46, XX от 69,XXX или 46, XY от 69,XXY. Кроме того, aCGH не может выявлять однородительские дисомии. аCGH, используемый для ПГТ-А во всех коммерческих лабораториях, может идентифицировать только анеуплоидию всей хромосомы и не предназначен и не валидирован для идентификации структурных хромосомных аберраций. Даже если чипы aCGH валидированы для мозаичных образцов, то надо понимать, что способность выявлять мозаицизм в образцах трофэктодермы все-таки ограничена.

По некоторым данным процент ошибок при aCGH составляет приблизительно 15–30%*.

*Capalbo A, Treff NR, Cimadomo D, et al. Comparison of array comparative genomic hybridization and quantitative real-time PCR-based aneuploidy screening of blastocyst biopsies. Eur J Hum Genet: EJHG. 2015;23:901–6. doi: 10.1038/ejhg.2014.222

В других валидационных исследованиях, при сравнении NGS и CGH, уровень конкордантности достигает 99%**.

**данные Paul R. Brezina, на 400 образцах

Секвенирование следующего поколения (NGS) при ПГТ-А

Секвенирование следующего поколения (NGS) — это технология, которая требует очень «аккуратной» амплификации ДНК, чтобы снизить вероятность возникновения артефактов во время процесса амплификации.

Впрочем, после амплификации ДНК в большинстве случаев артефакты могут быть идентифицированы и удалены с помощью биоинформатического анализа.

Для ПГТ-А используются две основные платформы

В настоящее время для ПГТ-А используются две основные платформы. Это MiSeq от Illumina и S5 от Thermo-Fisher Scientific. S5 является усовершенственной версией его предшественника PGM.
После амплификации ДНК приблизительно 50 нг каждого образца ДНК ферментативно расщепляется на миллионы фрагментов и объединяется для подготовки библиотеки. Подготовка библиотеки — это тот процесс, в котором все фрагменты ДНК «сшиваются» с адаптером и уникальным идентификатором — баркодом.
Хорошо приготовленная библиотека создает репрезентативное объективное представление нуклеиновых кислот и имеет решающее значение для точного молекулярного анализа.

После подготовки библиотеки либо выполняется этап мостиковой ПЦР. Для MiSeq происходит секвенирование путем синтеза на основе детекции флуоресценции, которая регистрируется с помощью оптической камеры.


Платформа позволяет одновременно анализировать до 24 образцов.

После подготовки библиотеки либо выполняется этап эмульсионной ПЦР. S5 использует эффект чувствительного к ионам поля, при котором детектируется сигнал по мере высвобождения иона водорода, что происходит каждый раз, когда ДНК-полимеразой во время секвенирования встраивается нуклеотидтрифосфат.

Высвобождение протона вызывает небольшое смещение pH, которое регистрируется с помощью чувствительного датчика.
Платформа масштабируема и позволяет одновременно анализировать 16, 24 или 96 образцов.

И MiSeq, и S5 секвенируют весь геном и  данные секвенирования сравнивают с референсным геномом человека.
Обе платформы позволяют провести анализ (от амплификации ДНК до формирования окончательного отчета) через 12-16 часов.
После анализа последовательности, возникают существенные различия между анализом данных MiSeq и анализом данных S5.

ДНК MiSeq проходит первый раунд показателей обеспечения качества, за которым следует анализ с использованием программного обеспечения BlueFuse.

MiSeqот Illumina

Анализ на S5 проходит первый раунд показателей обеспечения качества с использованием Torrent Browser, после чего проводится детальный анализ с помощью программного обеспечения Ion Reporter.

S5 и PGM от Thermo-Fisher Scientific

Существуют различия при анализе данных двух платформ. Главным образом, хочется отметить то, что биоинформатический алгоритм анализа данных в Ion Reporter является гибким, настраиваемым в зависимости от различных задач и доступным для подробного изучения. Подробную информацию можно найти в брошюре:

Развитие тетраплоидных мышей обычно протекает только до середины беременности. Тетраплоид:диплоидные химеры широко используются для выявления внеэмбриональных дефектов. Толерантность тканей к полиплоидии, по-видимому, зависит от генетического фона. Недавно были найдены етественно возникшие тераплоиды у видов грызунов указываеющие на то, что на редких генетических фонах удвоения генеома млекопитающитх могут оказаться совместимы с развитием, жизнью и плодовитеостью.

См. также
PRODUCTION OF COMPLETELY ES CELL-DERIVED FETUSES BY AGGREGATION WITH TETRAPLOID EMBRYOS

Generation of Mice by Cloning ES Cells:ES Cell-Tetraploid Embryo Aggregation

Тетраплоидные лягушкиТетраплоидные лягушки

В результате слияний клеток или ошибок во время клеточного деления клетки, а иногда и целые организмы становятся полиплоидными. Некоторые ткани (напр., склетные мышцы, гепатоциты, мегакариоциты, эпителий мочевого пузыря, миокард, синцитиотрофобласт и corpora lutea) часто полиплоидны в результате эндодупликаций генома или слияния клеток во время нормального развития (Keighren ana West, 1993). Др. клетки, такие как трофобластные гигантские клетки, рассматриваются как политенные, имеющие значительные количества хроматид на хромосому скорее, чем полиплоидные, имеющие большие количества сегрегирующих хромосом. Имея множественные копии генома клетки получают определенные преимущества, такие как устойчивость к повреждениям генома. Кроме того увеличиваются размеры клеток в результате полиплоидии или политении, что предоставляет им большую гибкость и силу в ткани, подверженной механическим стрессам, напр., эпителий мочевого пузыря (Brodsky and Uryvaeva, 1985). Большие размеры клеток позволяют также развивать ткани с меньшим их содержанием. Молекулярные механизмы, управляющие специфической для типа клеток резистентностью к полиплоидии остаются неизвестными. Часто отклонение от плоидности в 2n приводит к болезненым состояниям. Хотя тетраплодность у людей редка, последствия аномального количества хромосом и баланса генов нередки (Hassold and Hunt, 2001). Х0 кариотип ведет к синдрому Тёрнера, тогда как большинство др. моносомий даёт нежизнеспособные эмбрионы. Трисомии половых хромосом, с XXY (синдром Клянфельтера), XYY и ХХХ появляются с частотой примерно 1 на 1000 родов. Трисомии актосом обычно дают нежизнеспособные эмбрионы. Трисомии по хромосоме 8 и 9 вызывают летальные онтогенетические дефекты; трисомии 13, 18 и 21 (синдром Дауна) рождаются, хотя большинство не живёт и несколько мес. Это умственно отсталые, имеющие от слабых до тяжелых уродств (Larsen, 1993). Присутствие врожденных пороков сердца у индивидов с синдромом Дауна коррелирует с тремя полиморфизмами рестрикционных длин фрагментов в области COL6A1 на хромосоме 21 (Davies et al., 1995). Это указывает на то. что тяжесть синдрома, вызываемая анеуплидией м. б. модифицирована частично генетическим фоном. Хотя млекопитающие, по-видимому, особенно чувствительны к повреждающим эффектам полиплоидии, эволюция создала некоторые организмы с варьирующими значениями n. Xenopus laevis и Danio rerio считаются производными аллотетрапоидных предшественников. Аллотетрапоидные организмы являются следствием комбинации двух геномов близко родственных видов, которые содержат генетически отличающиеся наборы хромосом (Reiger et al., 1991). Слияние геномов, как полагают, играет роль в недавней эволюции только у одного млекопитающего. Красные viscacha крысы Tympanictromys barrerae обладают 100 аутосомными хромосомами и двумя половыми хромосомами, тогда как ближайший родственник обладает только 55 аутосомами и одиночным нобором половых хромосом (Contreras et al. , 1990; Gallardo et al., 1999). Очевидное удвоение генома затрагивает не только половые хромосомы, но и удвоение 43 хромосомных пар, это м. указывать на то. что эти хромосомы м. нести локусы, которые несовместимы в полиплоидией in vivo. Полная тетраплоидность, как правило, несовместима с нормальным развитием и жизнеспособностью. Редкие примеры спонтанной тетраплоидии обычно связаны с нарушениями цитокинеза в первом делении зиготических клеток, это происходит у мышей с частотой примерно в 0.1%. Показатели спонтанной тетраплоидии у крыс, кроликов и свиней подсчитаны равнми 0.4%, 0.3%, 0.1-3.4%, соотв.,(ЬсАууднб 1969ж Внифт and Baraniv, 1987) тогда как показатель у эмбрионов коров, продуцируемых in vitro состасляет 2.8% (Kawarsky et al., 1996). Кариотипы спонтанных абортусов у лбюдей выявляют частоты спонтанной тетраплоидии между 1.1 и 7.1% (Carr, 1972; Creasy et al., 1976; Hassold et al., 1980; Kajii et al., 1980), при этом большинство приходится на низший ранг. Они обычно характеризуются пустым хориональным мешком без каких-либо эмбриональных тканей (Warburton et al. , 1991). Аборты обычно происходят на 11 неделе менструального цикла, то считается, что смерть эмбрионов наступает значительно раньше (Carr, 1972). Однако несмотря на это известно 9 полностью тетраплоидных живорожденных, описанных в последние 30 лет. Такие дети обладали мириадом дефектов, включая spina bifida, скелетные и хрящевые аномалии, а также гипоплазию органов. Большинство имело лицевые дисморфологии (Warburton et al., 1991).

Experimental Production of Tetraploidy in Mammals

Nuclear Transfer into Zygotes


Inhibition of Cleavage


Blastomere Fusion


Development of the Teraploid Mouse Embryo

Gene Expression in Tetraploid Embryos

Существует ограниченное количество доказательств по измерению генных продуктов в тетраплодидных клетках мелкоптающих. немногие наблюдаения подчеркивают, что тетраплоидность не дает в результате простое удвоение белка или уровня экспрессии РНК, этот феномен согласуется с исследованиями растений и др. видов (Epstein, 1986; Osborn et a., 2003). Уровни общей РНК и malate dehydrogenase в тетраплоидной моруле выше в 1.5 раз по сравнению с диплоидным контролем (Eglitis and Wiley, 1981). Линия клеток фибробластов, произошедшая из человеческого тетраплоидного абортуса экспрессирует пониженную ферменттативную активность peptidase 5 по сравнению с диплоидной контрольной линией (Schmutz and Lin, 1983). Имеются также доказательства, подтвержающие, что два генома скомбинированные во время слияния бластомеров, м. не экспрессировать своих генов на одном и том же уровне. Когда два бластомера, каждый из которых нёс уникальнsq glucose phosphate isomerase (GPI)аллель на отличающихся генетических фонах (129/Sv и C57Bl/6-JHan), былиэлектрослиты, то соотношение экспрессии GPI было неэквивалентным, это указывает на то, что два слитых генома обнаруживают разные реакции на тетраплоидность (Petzoldt, 1991). На ст. морулы различия в уровнях двух изозимов GPI составляли 45:5. На ст. экспансии бластоциста соотношение оказывалось 41:58. Объединённые данные всё же выявляют четкую неодинаковость вклада. Исследования дозы гена у тетраплоидных эмбрионов млекопитающих редки, комбинировнные данные указывают на то, что тетраплоидность не вызвает простого удвоения клетки и всего её содержимого. Как уже отмечалось, полиплоидия существенна для нормальной функции многих клеток в теле, но она вредна для функционирования др. Мало данных о механизмах, с помощью которых доза гена регулируется в полиплидных клетках млекопитающих, очевидно, что эти клетки д. обладать генетическим механизмом для устранения негативных последствий полиплоидии. Наиболее приемлемым объяснением возникновения полиплоидных видов (напр.. T.barrerae) и редких наблюдений полиплоидных млекопитающих на поздней ст. беременности является то, что внутри генного пула у каждого из этих организмов, из которых возник тетраплоид существует комбинация аллелей, которая действует в пользу резистентности к полиплоидии.

Cellular Effects of Tetraploidy

Тетраплоидия вызывает несколько задокументированных эффектов на индивидуальные клетки плода, включая размер клеток, длину клеточного цикла и, наконец, общее количество клеток у тетраплоидного эмбриона. Тетраплоидные эмбрионы скорее всего имеют замедленный клеточный цикл и как следствие меньше клеток. Однако оазмер всего тетраплоидного эмбриона остаётся грубо эксивалентным диплоидному эмбрионоу той же ста. развития. Описывается обратная пропорциаональность между плоидностью и количеством клеток, начиная со стадии дробления и в течение всего органогенеза. Хотя ранее сообщалось. что клеточный цикл не затрагивается у у преимплентационных тетраплоибных зародышей, однако недавние подсчёты показали, что клеточный цикл примерно на 2 ч медленнее, чем в контроле (Beatty and Fischberg, 1951; Edwards, 1958). Различия обусловлены техническими трудностями выявления 2n и 4n эмбрионов и точного определения у них стадий развития (Henery et al., 1992). Общее количество клеток в тетраплоидном бластоцисте определено как 22 по сравнению с 69 клетками в диплоидном бластоцисте в том же исследовании (Koizumi and Fukata, 1995). Это не согласуется с данными др. исследований (Snow, 1976; Ефклщцылш уе al., 1977; Baraniv, 1983). Хотя количества клеток различны в одновозрастных тетраплоидных и диплоидных преимплантационных эмбрионах, они подвергаются компакции и бластуляции в одно и то же время (Koizumi and Fukuta, 1996). Различия в числе клеток, но не во времени клеточного цикла наблюдались у диплоидных и татраплоидных эмбрионов крыс (Krivokharchenko et al., 2002). Нет указаний, что общий преимплантационный размер тетраплоидов уменьшен. Очевидно, что тетраплоидные клетки в целом имеют больший объём (Snow, 1975, 1976; Ефклщцылш уе al., 1977; Niemierko and Opas, 1978). Ядерные клетки крови висцерального желточного мешка имеютв 4 раза большие объёмы по сравнению с их диплоидными аналогами и м.б. причиной гемморагий, наблюдаемых в тетраплоидных желточных мешках, т.к. крупные клетки д. проталкиваться через сосуды диплоидного диаметра (Snow,1975). Это увеличение клеточного объёма наблюдается также в тетрпалоидных фибробластах человека (Chang et al., 1983; Schmutz and Lin, 1983). Естественно возникающие полиплоидные или политенные клетки часто драматически увеличены в своём объме (напр. . трофобластный гигантские клетки или печеночные паренхимные клетки). Ядерные тетраплоидные клетки крови плода имеют объём ядра и клетки в среднем 1.7-2.3, т.е. почти теоретические 2 раза по сравнению с диплоидным контролем . Гистологические срезы тетраплоидных эмбрионов не выявляют существенного влияния размеров клеток на гистологию областей иных чем головной мозг и бранхиальные дуги за исключением размера очень крупных клеток (Kaufman, 1992). Нормальная гистология задокументирована у тетраплоидов в зародышевых клетках, гонадах (Kaufman, 1991a) и почках (Kaufman, 1992).

Developmental Potential of Tetraploid Mouse Embryos

Самое длительное выживание тетраплоидных эмбрионов мышей отмечено в аутбредной Q линии (Snow, 1973, 1975). 4 из 78 (5.1%) имплантантов доживали до конце беременности, 3 из них были рождены. Четвёртый был извлечен на Е17.5 и имел externalized органы. С использованием той же техники в др. работе (Tarkowski et al., 1977) не удалось получить эмбрионов более E10. 0 . Большинство эмбрионов начинало обнаруживают дефекты уже на 8-й день, включая ограниченную нейральную пластинку и «scanty» мезодерму. Сходные дефекты наблюдались также у кроликов (Ozil and Modlinski, 1986). При использовании гибридов (СВА Х C57Bl/6) F1 примерно 4% CD-обработанных зигот «ревертировало» к диплоидному хромосомному набору (Tarkowski et al.,1977) . Это пропорционально тому количеству, которое наблдалось в первом эксперименте (Snow). Tarkowski фактически отмечает, что до 20% его эмбрионгов развивалось как мозаики, правда до 10-го дня. Тетраплоидные клетки, скорее всего элиминировались из таких эмбрионов. Тетраплоидные жмбрионы, доживающие, хотя и с низкой частотой (1.7-4.2%) до 14 и 15 дня эмбриогенеза описаны на фоне, который включал, по крайней мере один из родителей (С57Bl x CBA) (Kaufman and Webb, 1990; Kaufman, 1991a,b 1992, Henery and Kaufman, 1992). На этих поздних стадиях были выявлены гомогенные тетраплоиды (Kaufman and Webb, 1990; James et al., 1992) . В средине беременности тетраплоидные эмбрионы в целом составляли по размеру 85% от размеров диплоидных эмбрионов (Henery et al., 1992). Дефекты у таких эмбрионов имели характерную морфологию перднего мозга и аберрантные глаза или отсутствие глаз, напоминающее голопрозэнцефалию. Эти дефекты были результатом аномальной миграции прехордальной мезодермы или нейрального гребня. Эта гипотеза былa подтверждена случайным появлением расщепленной или отклонившейся нервной трубки (Kaufman and McLaren, 1992). Наблдались также нарушения оси позвоночника и сердца, также как и случайные situs inversus и отсутствие шишковидной железы (Kaufman and Webb, 1990; Kaufman, 1991b, 1992). Т.к. подобных характеристик не было обнаружено у тетраплоидных эмбрионов (Snow 1973, 1975), то скорее всего его дожившеи до рождения «тетраплоидные» эмбрионы были скорее всего мозаиками (Henery et al., 1992). Правда его анализ эмбриональных и внеэмбриональных тканей исключает 2n:4n химеризм (Snow, 1975). Возможно они не были полностью тетраплидными. Вопрос остаётся нерешенным. Не выявлено существенных дефектов в гонадах у тетраплоидных эмбриорнов обоих полов (Kaufman, 1991a). Примордиальные зародышевые клетки и у XXYY и у ХХХХ животных обнаруживались на 11 день, из-за некоторой здержки миграции этих клеток из алантоиса в заднюю кишку. На 13-14.5 день развития пол таких эмбрионов опредялся морфологически. В отношении распределения половых хромосом у тетраплоидных эмбрионов человека отмечалось примерно на 50% больше XXXX тетраплоидных эмбрионов, чем XXYY у спонтанных абортусов (Sheppard et al., 1982; Surti et al., 1986). Предполагается, что хотя различия между человеком и мышью м.б. обусловлены межвидовыми отличиями, они м.б. также связаны и с 4n:2n мозаичностью ряда спонтанных абортусов человека (Kaufman, 1991a). Описания внеэмбрионального фенотипа тетраплоидов отсутствуют в литературе. Известно, что вес плаценты 4n:2n химерных животных значительно выше, чем в диплоидном контроле (James et al., 1995). Показатели сосудистых аномалий у разных полов м. б. смещены. ; исслдованных XXYY эмбриона обнаруживали сосудистые аномалии, а 3 эмбрионо ХХХХ в том же исследовании не обнаруживали подобных дефектов (Kaufman, 1992). В др. исследовании Х инактивация происходила пропорционально в эмбриорнальных и и мезодермальной ткани с двумя Х хромосомами у ХХХХ мышей, инактивация не обнаруживала склонности в отношении родительского происходения на ст. Е10.5 Однако в энтодермальной ткани наблюдалась преимущественная инактивация отцовской Х хромосомы. У XXYY эмбрионов инактивация наблюдалась нечасто (Webb et al., 1992). Возможно однако, что некоторые классы инактивации м. не определяться, если прошло только 10 дней после индукции тетраплоидности. Максимальное развитие тетраплоидных эмбрионов скорее зависит от линии. Анализ линий, которые использовались для продукции тетраплоидов и химер приведен в Табл. 1. Наиболее продвинутое развитие тетраплоидных эмбрионов наблюдалось у (C57Bl x CBA)F1 гибридных самок, скрещенных с Rb(1.3)Bnr самцами или аутбредной Q линии (Snow, 1973, 1975, 1976). В каждом из этих случаев использованая гибридная линия давала очнь редко продвинутое развитие. Всё это указывает на полигенный механизм управления толерантностью плодов к тетраплоидности.

Tissue-Specific Effects of Tetraploidy: 4n:2n Mouse Chimeras

Хотя мозаицизм 4n:2n препятствует получению чистых тераплоидов, он используется как мощная техника в современной биологии развития. Комплементация тераплоидных эмбрионов позволяет восстанавливать внеэмбриорнальные фенотипы. Этот процесс происходит в результате преимущественно тенденции диплоидных, особенно ES, клеток преимуществнено колонизировать эмбриональные ткани, когда они ассоциированы с тетраплоидным эмбрионами (Beddington and Robertson, 1989). Хотя условный нокаут используется с тем же самым исходом, описаны лишь мыши, экспрессирующие Cre рекомбиназу только эпибласт-специфическим способом (Tallquist and Soriano, 2000). Нет сообщений об экспрессии Cre, саецифичной для трофобласта или висцеральной энтодермы мышей. Тенденция ES клеток вносить вклад в эмбриональный клон, скомбинированный с тетраплоидной комплементацией внеэмбриональных фенотипов такж м.б. использоваться для продукции эмбрионов почти на 100%, происходящих из ES клеток (Nagy et al., 1993). Эта техника адаптирована теперь и к крупному рогатому скоту (Iwasaki et al., 1999, 2000) и свиньям (Prather et al., 1996).

Blastocyst Injection vs. Aggrergation for Making 4n:2n Chmeras

Химеры м.б. получены агрегацией двух отдельных эмбрионов или инъекцией чущеродной клетки непосредственнов ранний эмбрион. Метод инъекуии m,kfcnjwbcnf наиблолее прямой по получению химер. Продукция химерных мышей из редко пересаживаемых ES клеток не позволяет выявить существенных различий между двумя техниками, когда химеры анализируются в средине беременности (Peli et al., 1996) или по их способности давать зародышевую линию (Wood et al., 1993). Инъекция в бластоцист однако м.б. более пригодной для продукции химер из ES клеток после высокого количества пассажей (Wang et al., 1997). Инъекции бластоцистов не нуждаются в (иногда трудоёмких) манипуляциях «sticky» и более гибких тетраплоидных бластоцитов. По этой причине различия в текстуре возможны в несколько раз. Во-первых, тераплоидный бластоцист имеет меньше клеток, с которыми устанавливается межклеточная адгезия. Во-вторых, удвоение объёма сферы не вызывает удвоения поверхностной области. Объём и поверхность связаны фактором r/3. Учитывая средний размер клеток (Henery and Kaufman, 1992) м. подсчитать увеличение площади поверхности. Так 100% увеличение объёма эритроцита ведет к увеличению на 51% поверхности. Поэтому меньшее количество клеток в тетраплоидном бластоцисте м. приводить к снижению способности слипаться др . с др. по сравнению с маленькими клетками, более многочисленными в диплоидном бластоцисте. В-третьих, тетраплоидные эмбрионы обычно культивируются до стадии бластоциста in vitro в течение 2-3 дней перед инъекцией. Эта стратегия м. также вызывать фундаментальные изменения в строении (texture) эмбриона по отношению к свеже выделенным диплоидным бластоцистам, обычно используемым для инъекций. Однако имеются доказательства, что 4n:2n химеры. продуцируемые инъекциями бластоцистов м.б. более жизнеспособными, чем те, чтополучаются в результате агрегации. Кроме того инъекции в бластоцисты позволяют градировать и индивидаульно отбирать ES клетки на базе их морфологии. Тогда как агрегация происзводится с группой ES клеток, где отбор невозможен. Использование агрегационных химер несколько более популярно для продукции 4n:2n химер. Причиной м.б. то, что агрегационные химеры м. создаваться по 100-150 штук в час по сравнению с синъекциями (20-30) (Wood et al., 1993). Агрегационые химеры не нуждаебютс в разработке инъекционных аппаратов и нуждаются в меньшей профессирональной практике…

Development of 4n:2n Chimeras

Гомогенные тетраплоидные мышиные эмбрионы способны развиваться до предгаструлы, а ингода до более поздних стадий. Химерные эмбрионы часто доживают до рождеия. У таких химер тераплоидные клетки недопредставленны в сосбственно эмбрионе из-за селективных несоответствий с 2n клетками. Первые 4n:2n мозаичные мыши были получены при обработке двух- и 4-клеточных эмбрионов с помошью CD (Tarkowski et al., 1977). У таких эмбрионов отмечалось очень низкая пропорция тетраплоидных клеток, присутствующих в собственно эмбрионе ( менее 4%) но до 50% во вреэмбриональных тканях. После улучшения техники др. авт. было получено 2 живорожденных из 59 4n:2n химер (Lu and Market, 1980). Выявленн примерно 3% вклад тетраплоидных клеток в костный мозг одной химеры. Эта находка указывает на то, что при определенных условиях тетраплоидные клетки м. сохраняться и постнатально. Механизм, с помощью которого тетраплоидные клетки преимущественно ограниченны внеэмбриональными тканями, неизвестен. Имеется, по-видимом, множество факторов, обусловливающих низкий вклад тетраплоидных клеток в эмбрион, включая приспособленность, сниженный онтогенетический потенциал или дифференциаьная скорость клеточных делений. Внеэмбриональные ткани обладают большим количеством естественных полиплоидных клеток, включая трофобластные гигантские и синцитиотрофобластные клетки. Так как функции этих клеток включают и резистентность к повреждающему эффекту полиплоидии, поэтому экспериментально индуцированные тетраплоидные клетки будут более жизнеспособными в этих тканях, толерантных к полиплоидии. Имеются данные, подтверждающие эту идею в др. областях тела, включая и те, что происходят из собственно эмбриона. Напр., тетраплоидные клетки персистируют в развивающейся печени в средине беременности у химерных мышей (Goto et al., 2002). Имеются доказательства, указывающие на то, что большие клетки м. обнаруживать тенденцию колонизировать трофэктодремльаный клон независимо от плоидности. В этом случае предполагется, что большие клетки механически силой нгаправляются к наружным краям компактирующей морулы и впоследствии адоптируют судьбу внеэмбриональных клеток (Everett and West, 1996; Tang and West, 2000). Эти факторы, по-видимому, начинают действовать вскоре после формирования химеры, склоняя ткани к той или иной плоидности. Тенденция тетраплоидных клеток колонизировать трофэктодерму обнаруживается на ст. бластоциста. Эта колонизация м. сопровождаться отбором против тераплоидных клеток в ICM, хотя спустя 4.5 дней развития тетраплидные клетки все ещё присутствуют на уровне 13% (Everett and West, 1996, 1998; Everett et al., 2000). По мере развития тетраплоидные клетки всё меньше и меньше вкладывают в тканиЮ, производные ICM (Tarkowski et al., 1997; Nagy et al., 1990; James et al., 1995; Wang et al., 1997; Tang and West, 2000; Goto et al., 2002). На ст. 12.5 минорный влад тетраплоидных клеток в собственно эмбрион, наблюдаемый в малых частях сердца, печени и кожи (Goto et al., 2002). У 5 из 60 новорожеденных или старых мышей, вклаю тетраплоиных клеток определялся по кариотипу или с помошью GPI метода составлял 3-50% в сердце, крови, лёгких и печени; тетраплоидии не выявлено у остальных 55 оставшихся мышей (Lu and Markert, 1980; Nagy et al., 1993; Wamg et al., 1997). Снова онтогенетический потенциал тетраплоидных клеток, как полагают, обнаруживает линейную зависимость. Взрослые клетки, если это разрешено, спонтанно сливаются с ES клетками и продуцируют клетоыные линии с тетраплоидным или с почти тетраплоидным кариотипом (Matveeva et al., 1998; Terada et al., 2002; Yung et al., 2002). В двух работах по сличнию взрослых клеток выявлен высокий показатель потери хромосом после после слияния (Terada et al., 2002). Oдин набор продуктов слияния с ES клетками оказался неспособным давать химеры после инъекции в диплоидный бластоцист V. Др. почти тетраплоидная линия клеток обладала нестабильностью и потеряла почти половину хромосом после 5-7 пассажей (Matveeva et al., 1998). В одном случае однако Продукты слияния с ES клетками были способны давать кишечные, почечные, кардиальные и печеночные клетки после инъекции этих клеток в диплоидный блпстоцист. Кариотип клеточной линии был тетраплоидным или почти тетраплоидным (Ying et al., 2002), хотя осталось неясным, какая линия клеток продуцировала химеры. т.к.прошло много пассажей между кариотипированием и инъекцией в бластоцисты.

Types of 4n:2n Chimeras

4n:2n химеры м.б. получены путём комбинировния 4n эмбрионов с (1) 2n эмбрионами, (2) с ES клетками или (3) с клетками внутренней клеточной массы (ICM). В каждом случае тетраплоидные клетки вносят вклад преимущественно во внеэмбриорнальные ткани. однако распределение клеток иногда модифицируется типом полученных химер. Агрегация тетраплоидной морулы с диплоидной морулой часто используется в экспреиментах по комплементации тетраплоидных эмбрионов, чтобы сегрегировать фенотипические эффекты данного генетического фона на эмбриональные скорее, чем внеэмбриональные ткани с помошью агрегации мутаных эмбрионов с тетраплоидными дикого типа эмбррионами. Эта техника успешно применяется для преодоления внеэмбриональной летальности и продукции взрослых мутантных гомозигот мышей и для изучения внеэмбриональных дефектов (Guillemot et al., 1994). В др. исследованиях эта техника использования для преодоления внеэмбриональных дефектов для изучения дополнительных эмбриональных дефектов (Luo et al., 1997; Rossant et al., 1998; Sibilia et al., 1998; Yamamoto et al., 1998; Li et al., 2000; Gallicano et al., 2001; Hobbs et al., 2002). Диплодные эмбрионы, агрегированные с тетраплоидными эмбрионами д. обладать более высокой степенью онтогенетического потенциала. В этом случае диплоидные клетки, как ожидается, будут вносить вклад и в эмриональные и внеэмбриональные ткани.


Рис.2  |  Embryos derived from Hprt-deficient ES cells by tetraploid aggregation.

Получены химерные эмбрионы из двухклеточных тетраплоидных эмбрионов и диплоидных ES клеток (Nagy et al., 1990, 1993). Ограниченная способность ES клеток колонизировать трофобласт, сегрегация диплоидных и тетраплоидных клеток в таких химерах более очевидна (Beddington and Robertson, 1989). Основным нерешенным вопросом остаётся, как клетки распределяются между имплантацией и 7.5 днём эмбриогенеза. Хотя недавние исследования сообщили о почти эквивалентном количестве и вкладе тетраплоидных и диплоидных клеток во время гаструляции химер, полученных с помошью агрегации эмбрионов (Goto et al., 2002). Эти результаты не достигнуты на химерах полученных из ES клеток. Агрегация или инъекция ES клеток в др. дикого типа тетраплидные эмбрионы используются многими в одном и том же типе экспериментов. Это используется и для продукции мутантных эмбрионов непосредственно из ES клеток для анализа их мутантного фенотипа без генерации животных с помощью скрещиваний химер по зародышевой линии. Эта стратегия особенно пригодна в случае гетерозиготных эмбриональных леталей Vegf аллеля. Продукция 4n:Es клеточных химер позволяыет анализировать эмбриональные дефекты как у гетерозиготных, так и гомозиготных мутантных эмбрионов без использования условных аллелей (Carmellet et al., 1996, 1997). Хотя большинство мутаций не отягощено гетерозиготной летальностью, др. преимущество этого подхода заключается в быстрой оценке эмбрионального фенотипа и в неограниченной продукции мутантов без разведения. Возможно также увкорение традиционного процесса разведения с тетраплоидными эмбрионами, путём создаения химер из прицельно изменённой ES линии, которая спонтанно потеряла Y хромосому. Т.к. Х0 самки жизнеспособны и фертильны, то получемые химеры с помощью этой техники м.б. скрещены с нормальными самцовыми химерами из той же самой targeted (XY) ES линии для более быстрой продукции гомозиготного мутантного потомства (Eggan et al., 2002).

ICM агрегация сходна с агрегацией с ES клетками, В этом случае ICMs выращивают как и на первой ступени изоляции ES клеток. Затем они дизагрегируются с помощью протеаз и комбинируются непосредственно с тетраплоидными эмбрионами. Это создаёт популяцию клеток с гетерогенными эмбриональнымит онтогенетическими потенциалами, включая субнаборы плюритотентных ES-подобных клеток. Это первоначально использовали в качестве контроля для оригинальных исследовний, осуществляемых с помошью 4n:ES агрегационных химер. 4n:ICM клеточные агрегаты продуцируют больший процент здоровых новорожеденных, чем 4n:ES клеточные химеры (Nagy et al., 1990). Эти различия в жизнеспособности м.б. показателем того, что зддоровые химеры, продуцируемые с помошью агрегации скорее всего обуслвоены различиями в донорских клетках скоере, чем проблемами техники агрегации (Nagy and Rossant, 2001). Недавно этот тип химер был получен, чтобы показать. что низкая жизнеспособность эмбрионов, клонируемых с помощью трансплантаций ядер не только связана с неспособностью клонируемой трфэктодермы, но и с субоптимальным онтогенетическим потенциалом ICM (Amano et al., 2002).

диплоидных фибробластных клеток человека в стадии старения; Цикл через полиплоидию к митотическим клеткам

  • Barrett, M. T .; Pritchard, D .; Palanca-Wessel, C .; Андерсон, Дж .; Рид, Б. Дж. Молекулярный фенотип спонтанно возникающих 4N (G2-тетраплоидных) промежуточных продуктов неопластической прогрессии в пищеводе Барретта. Cancer Res. 63: 4211–4217; 2003.

    PubMed CAS Google ученый

  • Bibbo, M .; Dytch, H.E .; Аленгхат Э.; Bartels, P.H .; Wied, G.L. Профили плоидности ДНК как прогностические индикаторы поражений CIN. Являюсь. J. Clin. Патол. 92: 261–265; 1989

    PubMed CAS Google ученый

  • Dimri, G.P .; Ли, X .; Basile, G. et al. Новый биомаркер идентифицирует стареющие клетки человека в культуре и в стареющей коже in vivo. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 92: 9263–9367; 1995.

    Статья Google ученый

  • Duensing, S.; Duensing, A .; Crum, C.P .; Munger, K. Вызванный онкопротеином E7 вируса папилломы человека типа 16 аномальный синтез центросом является ранним событием в развивающемся злокачественном фенотипе. Cancer Res. 61: 2356–2360; 2001

    PubMed CAS Google ученый

  • Edgar, B.A .; Орр-Уивер, Т. Л. Циклы эндорепликации клеток: больше за меньшие деньги. Cell 105: 297–306; 2001.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Эренпрейза, Дж.А .; Cragg, M. S .; Бахрома, B .; Шарахов, И .; Иллидж, Т. М. Высвобождение митотических потомков гигантскими клетками из облученных клеточных линий лимфомы Беркитта. Cell Biol. Int. 24: 635–648; 2000

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Erenpreisa, J .; Kalejs, M .; Ianzini, F .; Kosmacek, E.A .; Mackey, M. A .; Эмзиньш, Д .; Cragg, M. S .; Иванов, А .; Иллидж, Т. М. Сегрегация геномов в полиплоидных опухолевых клетках после митотической катастрофы.Cell Biol. Int. 29: 1005–1011; 2005a.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Erenpreisa, J .; Kalejs, M .; Крэгг, М.С. Митотическая катастрофа и эндомитоз в опухолевых клетках: эволюционный ключ к молекулярному решению. Cell Biol. Int. 29: 1012–1018; 2005b.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Galipeau, P.C .; Cowan, D. S .; Санчес, К.А .; Barrett, M. T .; Emond, M. J .; Левин, Д. С .; Рабинович, П. С .; Reid, B.J. Аллельные потери 17p (p53), популяции 4N (G2 / тетрафлоид) и прогрессирование анеуплоидии в пищеводе Барретта. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 93: 7081–7084; 1996.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Галицкий, Т .; Saldanha, A.J .; Styles, C. A .; Lander, E. S .; Финк, Г. Р. Плоидность регуляции экспрессии генов. Science 285: 251–254; 1999 г.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Gorman, S.D .; Кристофало, В. Дж. Анализ позиции остановки G1 стареющих клеток W138 с помощью ядерной флуоресценции хинакрина дигидрохлорида. Доказательства позднего ареста G1. Exp. Cell Res. 167: 87–94; 1986.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Hahn, W. C .; Counter, C. M .; Лунберг, А.S .; Bejiersbergen, R.L .; Brooks, M. W .; Вайнберг, Р. А. Создание опухолевых клеток человека с определенными генетическими элементами. Nature 400: 464–468; 1999.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Hayflick, L .; Moorhead, P. S. Серийное культивирование штаммов диплоидных клеток человека. Exp. Cell Res. 25: 585–621; 1961.

    Статья Google ученый

  • Huschtscha, L.Я.; Благородный, Дж. Р .; Neuman A. A .; Мой, E. L .; Barry, P .; Melki, J. R .; Реддел, Р. Р. Потеря экспрессии p16INK4 из-за метилирования связана с увеличением продолжительности жизни эпителиальных клеток молочной железы человека. Cancer Res. 58: 3508–3512; 1998.

    PubMed CAS Google ученый

  • Illidge, T. M .; Cragg, M. S .; Бахрома, B .; Olive, P .; Erenpreisa, J. A. Полиплоидные гигантские клетки обеспечивают механизм выживания мутантных клеток p53 после повреждения ДНК.Cell Biol. Int. 24: 621–633; 2000.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Krtolica, A .; Parrinello, S .; Lockett, S .; Desprez, P.-Y .; Campisi, J. Старые фибробласты способствуют росту эпителиальных клеток и онкогенезу: связь между раком и старением. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 98: 12072–12077; 2001.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Кун, Э.М .; Therman, E .; Susman, B. Амитоз и эндоциклы в раннем культивированном трофобласте мыши. Плацента 12: 251–261; 1991.

    PubMed CAS Google ученый

  • Lanks, K. W .; Леман, Дж. М. Синтез ДНК клетками L929 после воздействия доксорубицина. Cancer Res. 50: 4776–4778; 1990.

    PubMed CAS Google ученый

  • Lo, D. C .; Allen, F .; Брокес, Дж. П.Реверс мышечной дифференцировки во время регенерации уродельной конечности. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 90: 7230–7234; 1993.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Macieira-Coelho, A .; Ponten, J .; Филипсон, Л. Ингибирование цикла деления в конфлюэнтных культурах фибробластов человека in vitro. Exp. Cell Res. 43: 20–29; 1966

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Мацумура, Т.; Pfendt, E.A .; Хейфлик, Л. Синтез ДНК в штамме диплоидных клеток человека WI-38 во время старения in vitro. J. Gerontol. 34: 323–327; 1979а.

    PubMed CAS Google ученый

  • Matsumura, T .; Зеррудо, З .; Hayflick, L. Старые диплоидные клетки человека в культуре: ДНК выживания, синтез и морфология J. Gerontol. 34: 328–334; 1979b

    PubMed CAS Google ученый

  • Нигг, Э.Центтосомные аберрации: причина прогрессирования рака. Nat. Преподобный Рак 2: 815–825; 2002.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Nishio, K .; Иноуэ, А .; Qiao, S .; Kondo, H .; Мимура, А. Старение и цитоскелет: гиперпродукция виментина вызывает морфологию фибробластов человека, подобную старению. Histochem. Cell Biol. 116: 321–327; 2001.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Паркер, Г.А .; Touitou, R .; Allday, M. J. Epstein-Barr, вирус EBNA3C может нарушать множественные контрольные точки клеточного цикла и индуцировать ядерное деление, оторванное от цитокинеза. Онкоген 19: 700–709; 2000.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Rabinovitch, P. Регуляция скорости роста человеческих фибробластов как фракцией нециклирующих клеток, так и вероятностью перехода показана путем роста в 5-бромдеоюридине с последующей проточной цитометрией Hoecht 33258.Proc. Natl. Акад. Sci. USA 80: 2951–2955; 1983.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Реддел Р. Р. Роль старения и иммортализации в канцерогенезе. Канцерогенез 21: 477–484; 2000.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Rieder, C. L .; Ходжаков, Митоз под микроскопом: успехи в изучении живых делящихся клеток.Science 300: 92–96; 2003.

    Статья CAS Google ученый

  • Rittling, S. R .; Брукс, К. М .; Cristofalo, V.J .; Базерга Р. Экспрессия зависимых от клеточного цикла генов в молодых и стареющих фибробластах WI-38. Proc. Natl. Акад. Sci. США 83: 3316–3320; 1986.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Романов С.Р .; Kozakiewicz, B.K .; Холст, К.Р.; Stampfer, M. R .; Haupt, L.M .; Tlsty, T. D. Нормальные эпителиальные клетки молочной железы человека спонтанно избегают старения и приобретают геномные изменения. Nature 409: 633–637; 2001.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Saksela, E .; Мурхед П.С. Анеуплоидия в дегенеративной фазе серийного культивирования штаммов клеток человека. Proc. Natl. Акад. Sci. США 50: 390–395; 1963.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Шнайдер, Э.L .; Фаулкс, Б. Дж. Измерение содержания ДНК и объема клеток в стареющих фибробластах человека с использованием проточного многопараметрического анализа отдельных клеток. Exp. Cell Res. 98: 298–302; 1976.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Серрано, М .; Бласко, М. А. Акцент на старении. Curr. Opinion Cell Biol. 13: 748–753; 2001.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Шервуд, С.W .; Раш, Д .; Ellsworth, J. L .; Шимке, Р. Т. Определение клеточного старения в клетках IMR-90: анализ проточной цитометрии. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 85: 9086–9090; 1988.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Smith, J. R .; Перейра-Смит, О. М. Репликативное старение: последствия для старения in vivo и подавления опухоли. Science 273: 63–67; 1996.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Солари, Э.; Domenget, C .; Gire, V .; Woods, C .; Lazarides, E .; Rousset, B .; Jurdic, P. Многоядерные клетки могут непрерывно генерировать мононуклеарные клетки в отсутствие митоза: исследование клеток линии птичьих остеокластов. J. Cell Sci. 108: 3233–3241; 1995.

    PubMed CAS Google ученый

  • Stampfer, M. R .; Ясвен П. Иммортализация эпителиальных клеток человека как этап канцерогенеза. Письма о раке 194: 199–208; 2003.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Штейн, Г.ЧАС.; Аткинс, Л. Мембранно-связанный ингибитор синтеза ДНК в стареющих диплоидных фибробластах человека: характеристика и сравнение с ингибитором покоящихся клеток. Proc. Natl. Акад. Sci. США 83: 9030–9034; 1986.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Thompson, K. V. A .; Холлидей, Р. Хромосомные изменения во время старения фибробластов человека MRC-5 in vitro. Exp. Cell Res. 96: 1–6; 1975.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Веллозу, К.П.; Кумар, А .; Tanaka, E.M .; Brockes, J.P. Генерация мононуклеарных клеток из постмитотических мышечных трубок происходит в отсутствие клеточной прогрессии. Differentiation 66: 239–246; 2000.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Вален, К. Х. Анкоридж в зависимом росте трансформированных SV40 эпителиальных клеток человека из околоплодных вод: различия внутри и среди доноров клеток. In Vitro 18: 203–212; 1982.

    PubMed CAS Google ученый

  • Вален, К.H. Происхождение трансформированных клеток; исследования спонтанной и индуцированной трансформации клеток в культурах клеток сумчатых, улиток и амниоцитов человека. Рак Генет. Cytogenet. 133: 45–54; 2002.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Вален, К. Х. Спонтанная трансформация клеток: кариопласты, полученные из культур многоядерных клеток. In vitro Cell. Dev. Биол. 40А: 150–158; 2004.

    Статья Google ученый

  • Вален, К.H. Расщепленные кариопласты из многоядерных фибробластных клеток содержат центросомы и меняют свою морфологию на митотические клетки. Cell Biol. Int 29: 1057–1065; 2005.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Wright, W. E .; Шэй, Дж. У. Теломеры и опухоли времени: клеточное старение больше, чем противораковый механизм. Trends Cell Biol. 5: 293–296; 1995.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Янишевский, Р.; Мендельсон, М. Л .; Mayall, B.H .; Кристофало, В. Дж. Пролиферативная способность и содержание ДНК стареющих диплоидных клеток человека в культуре: цитофотометрический и авторадиографический анализ. J. Cell Physiol. 84: 165–170; 1974.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Зыбина, Е.В .; Зыбина Т.Г. Политенные хромосомы в клетках млекопитающих. Int. Rev. Cytol. 165: 53–119; 1996.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • Зыбина, Е.V .; Зыбина, Т. Г .; Богданова, М. С .; Stein, G. I. Распределение хромосом по всему геному во время ядерной фрагментации гигантских клеток трофобласта Microtus rossiaemeridionalis , изученных с использованием расположения гоносомного хроматина. Cell Biol. Int. 29: 1066–1070; 2005.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • диплоидных фибробластных клеток человека в стадии старения; Цикл от полиплоидии к митотическим клеткам на JSTOR

    Абстрактный

    Ранее было обнаружено, что стареющие клетки могут претерпевать модифицированный клеточный цикл с митотическими клетками в качестве конечного результата.Основные события цикла начались с полиплоидизации, за которой следовала деполиплоидизация до многоядерных клеток (МНК). Эти последние клетки продуцировали одноядерные клетки-потомки, которые могли экспрессировать деления митотических клеток. В этом отчете акцент делается на поздних стареющих фибробластах, которые демонстрируют связанные со старением изменения в морфологии клеток до больших плоских клеток. Перед фотографированием живых клеток культуры плоских клеток поддерживали в течение нескольких месяцев в одних и тех же колбах для культивирования и, следовательно, считали, что они находятся в поздней фазе старения.Все клеточные события, описанные выше, присутствовали в этих старых клеточных культурах. Покадровые снимки показали движения митотических дочерних клеток друг от друга, а выравнивание хромосом на метафазной пластине было видно в других митотических клетках. Эти данные ставят под сомнение распространенное мнение, что клеточное старение необратимо и, следовательно, является противоопухолевым механизмом. Новое открытие заключалось в том, что спайк в полиплоидных клетках в фазе, близкой к старению, состоял из клеток с парами сестринских хромосом от эндоредупликации ДНК (два цикла синтеза ДНК и отсутствие митоза).Отсутствие клеток с 92 одиночными хромосомами (например, тетраплоидных клеток G2) предполагает, что эти полиплоидные клетки также прошли через измененный клеточный цикл. Теперь вопрос в том, являются ли эти атипичные полиплоидные клетки субпопуляцией в состоянии старения, которая может подвергаться циклическому переходу от полиплоидии к митотическим клеткам с уменьшенным геномом.

    Информация о журнале

    Клеточная биология и биология развития in vitro — Animal представляет рецензируемые рукописи, посвященные культивированию in vitro клеток, тканей, органов и опухолей беспозвоночных и позвоночных.Этот журнал, публикуемый ежемесячно с объединенными выпусками в июле / августе и ноябре / декабре, является обязательным к прочтению для ученых, работающих в области культуры клеток и тканей позвоночных и беспозвоночных. Предлагает оригинальные статьи по актуальным вопросам, например, специальные серии статей о стволовых клетках и исследования NASA по биотехнологии / клеточной науке в условиях микрогравитации. Клеточная биология и биология развития in vitro. Animal продолжает исследования в области клеточной биологии и биологии развития in vitro. Клеточная биология in vitro и биология развития была частично продолжена In vitro Cellular & Developmental Biology.Завод в январе 1991 года и продолжение In vitro Cellular & Developmental Biology. Животное в марте 1993 года.

    Информация об издателе

    Общество биологии in vitro (SIVB) было основано в 1946 году как Ассоциация культур тканей для содействия обмену знаниями о биологии клеток, тканей и органов растений и животных (включая человека) in vitro. Основное внимание уделяется биологическим исследованиям, разработкам и приложениям, имеющим значение для науки и общества.Миссия осуществляется через публикации Общества; национальные и местные конференции, встречи и семинары; и через поддержку учебных инициатив в сотрудничестве с образовательными учреждениями. С годами SIVB расширился, чтобы создать среду для научного обмена и междисциплинарного взаимодействия с целью развития существующих и будущих систем для биологии in vitro.

    Долговечность диплоидных и полиплоидных фибробластов человека

    Напечатано в Швеции. Авторские права Q 1978 г. издательством Academic Press.Inc. Все права на воспроизведение в любой форме защищены. 0014-4827 / 78 / l 12% 0281 $ 02.00 / O

    Experimental Cell Research 112 (1978) 281-287

    ДОЛГОВЕЧНОСТЬ ДИПЛОИДНЫХ И ПОЛИПЛОИДНЫХ ФИБРОБЛАСТ ЧЕЛОВЕКА Доказательства против соматической мутации

    Теория клеточного старения

    кВА ТОМПСОН и Р. ХОЛЛИДЕЙ Национальный

    Институт медицинских исследований,

    Риджуэй,

    Милл-Хилл, Лондон NW7 IAA, Великобритания

    РЕЗЮМЕ Диплоидный штамм MRC легких плода человека, тибробласты легких обрабатывались колхицином в течение 3 или 6 часов, и было обнаружено, что выжившая популяция содержит до 60% полиплоидных (в основном тетраплоидных) клеток.Продолжительность жизни обработанных культур существенно не отличалась от контрольных. Культуры разного уровня пассажа обрабатывали колхицином, и долю полиплоидов измеряли с интервалами на протяжении их последующего серийного пересева, пока не наступило старение и смерть. Во всех случаях было обнаружено, что доля полиплоидов оставалась постоянной до конца жизни. Это указывает на то, что скорость роста и продолжительность жизни диплоидов и полиплоидов очень похожи. Результаты совместимы либо с ошибкой белка, либо с программной теорией старения и предоставляют доказательства против любой теории мутаций, которая предполагает, что старение происходит из-за накопления рецессивных генетических дефектов или мутаций.

    С момента открытия Hayflick & Moorhead [5], что культивируемые человеческие фибробласты имеют определенную продолжительность жизни in vitro, многие лаборатории использовали эти клетки в качестве модельной системы для изучения процессов старения на клеточном уровне. Одна из возможностей, первоначально предложенная HayIlick [3], заключается в том, что клетки в конечном итоге прекращают рост в культуре, потому что они накапливают генетические повреждения на протяжении всей своей жизни, составляющей 40-60 удвоений популяции. Если генетические дефекты должны накапливаться в течение длительного периода времени, они должны возникать с довольно высокой частотой, более одного на деление клетки, и они также должны быть в первую очередь рецессивными, поскольку клетки с доминантными дефектами или мутациями будут отбираться против.Отсюда следует, что тетраплоидные клетки должны жить дольше, чем диплоидные, потому что они могут накапливать больше рецессов до того, как проявятся симптомы старения. Мы обнаружили, что обработка культур штамма диплоидных фибробластов MRC-5 колхицином дает рост популяций жизнеспособных клеток с высокой долей полиплоидов (в основном тетраплоидов), и мы использовали эти популяции для проверки теории старения соматической мутации. Наши результаты показывают, что диплоиды и полиплоиды имеют одинаковую или похожую продолжительность жизни.

    МАТЕРИАЛЫ

    И МЕТОДЫ

    Клетки Во всех экспериментах использовали мужской штамм фибробластов легких плода MRC-5. Клетки были получены от J. P. Jacobs (Национальный институт биологических стандартов и контроля, Хэмпстед, Лондон), где штамм был первоначально выделен и охарактеризован [10]. Два ExperExp Cdl Rrs 112 (1978)

    282

    Томпсон и Холлидей

    Таблица 1. Индукция полиплоидии колхицином. Используемая культура фибробластов MRC-5 была на 15 пассаже.

    I: 4 1: 4 I: 4 I: 4 1: 16 1: 16

    3 6 3 6 3 6

    1:32 1:32

    3 0 (контроль)

    Последующие разбиения ”114 I: 4 3×1: 4 3×1: 4 1: l I: 1 и 1: 4 MICb 2×1: 4

    % Полиплоидные клетки 44 46 51 58 2: 41 5

    ”Для подсчета процента полиплоидных клеток, выживших после начальной обработки необходимо пересеять (обычно разделение 1: 4) с последующей остановкой колхицина для накопления клеток в метафазе.* Среду меняли через 8 дней, и клетки оценивали на полиплоидию еще через 5 дней без пересева. Были начаты эксперименты с клетками на пассаже 15 и пассаже 23 соответственно.

    Условия роста Клетки выращивали, как описано в Thompson & Holliday [19], с использованием среды Игла (диплоид Gibco-BME [Earle’s], кат. № G-13), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) (поставляемой Gibco Biocult, Глазго, Шотландия), 10% триптозофосфатный бульон (Difco-Bacto), 200 Ед пенициллина и 200 пг / мл стрептомицина.Значение pH доводили бикарбонатом натрия до 7,27,3. Клетки отделяли трипсином / версеном (1,25 мг / л, 0,1 г / л) и субкультивировали с соотношением деления 1: 2 или 1: 4. Среду, содержащую колхицин (0,8 пг / мл среды), добавляли через 2 дня после разделения на период 3 или 6 часов. Затем клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и инкубацию продолжали с нормальной питательной средой. После слияния клеток субкультивирование продолжали обычным способом.

    Процедура клонирования Использовали питательную смесь Ham’s F12 Nutrient Mixture Medium (Gibco Biocult, Глазго) с добавлением 2% исходного раствора заменимых аминокислот (Gibco Biocult), 0.02% глутамина, 17% фетальной телячьей сыворотки (Gibco Biocult), 200 Ед пенициллина и 200 пг / мл стрептомицина. Клетки высевали для клонирования в чашки Петри диаметром 10 см при плотности 18 и 5 ~ 10 мкл / чашку. Сначала колонии выделяли стерильным стеклянным кольцом (диаметром 7 мм и 11 мм) с использованием стерильной силиконовой смазки для высокого вакуума для фиксации на планшете. Затем клетки отделяли трипсимверсеном и переносили на чашки диаметром 30 мм. Когда они сливались, они были разделены в соотношении 1: 2 на 1 унцию. стеклянная бутылка. Клетки переносили Exp Cell Res 1 I2 (1978)

    аналогично в 2 унцию.бутылки, и, в конечном итоге, в стеклянные бутылки на 150 мл. Исследования продолжительности жизни клонированных клеток были продолжены в носовых сосудах, разделенных в соотношении 1: 2 или 1: 4. Подсчет клеток (Coulter Counter Model A) производился в каждой субкультуре.

    Подсчет хромосом Клетки в средней логарифмической фазе были остановлены при делении 3-часовой обработкой колхицином (0,8 пг / мл) через два дня после последнего расщепления. Клетки фиксировали и окрашивали по методике Moorhead & Nowell [16]. Хромосомные препараты готовили с интервалами примерно 10 пассажей на протяжении жизни культур.Слайды сканировали при малом увеличении и подсчитывали количество диплоидов и полиплоидов. Сорок до 50 хромосом были оценены как диплоидные, более 50 — как полиплоидные. Большинство из них относились к диапазону тетраплоидов (80–100). Частота метафаз с более чем 100 хромосомами никогда не превышала 2%. В каждом образце подсчитывали от трехсот до 700 метафазных клеток, и количество полиплоидов выражали в процентах от общего подсчитанного количества. Подсчет хромосом в клонированных культурах был основан на интактных, а не диспергированных метафазах.

    РЕЗУЛЬТАТЫ Влияние обработки колхицином В предварительных экспериментах культуры фибробластов легких MRC-5 на 15-м пассаже обрабатывали колхицином. Эту обработку проводили через 2 дня после последнего разделения культуры — до того, как клетки стали сливаться. Это время, когда можно ожидать, что культура будет содержать максимальное количество делящихся клеток. После обработки и удаления колхицина неделящиеся клетки выглядели сморщенными и округлыми, и были небольшие участки, где клетки отделились от поверхности стекла.После 5-дневной инкубации с нормальной питательной средой клетки полностью восстановились, и культуральные флаконы сливались. Затем готовили слайды для хромосомного исследования с использованием (а) клеток сразу после того, как они достигли слияния после обработки; и (6) клетки, подвергшиеся 1 или 2 дальнейшим расщеплениям после обработки. Бутылки, выбранные для препаратов хромосом из (a) и (b), были разделены на 1: 2

    Долговечность

    Таблица 2. Долговечность

    диплоидных и полиплоидных

    культур MRC-5 Долговечность параллельных культур (пассажей)

    Среднее значение

    46 56 65 26 и 34 26 и 44 Контроль

    66, 68, 70, 70 59, 61, 62, 65 64, 64,66, 66 68, 70, 70, 70 66, 69, 69, 72 59, 61, 62, 65 64,64,66,66 71, 71, 72, 73

    68.5 61,7 65 69,5 69 61,7 65 71,7

    Продолжительность жизни обработанных культур

    Соотношение

    и инкубирование в течение 48 часов. Затем добавляли колхицин (0,8 пг / мл) для остановки клеток в метафазе и готовили слайды, как описано в разделе «Методы». Слайды также готовили из необработанных контрольных клеток. Полученные результаты представлены в таблице 1. Высокий процент полиплоидии был получен в клетках сразу после обработки колхицином, и этот процент оставался постоянным даже после 1-3 дальнейших удвоений клеток.Это указывало на то, что культуры пережили обработку колхицином, что клетки продолжали делиться и что субкультивирование не влияло на частоту полиплоидов. Поскольку не было очевидной разницы в процентном содержании полиплоидных клеток ob-

    Таблица 3. Индукция

    полиплоидии

    в MRC5

    283

    , подаваемых через 3 или 6 часов обработки колхицином, использовалась только 3-часовая обработка. во всех последующих экспериментах.

    обработанных колхицином

    Обработка колхицином при пассаже

    человеческих фибробластов

    Были проведены эксперименты для определения (а) продолжительности жизни культур, обработанных колхицином, по сравнению с контрольными культурами; (б) эффект лечения колхицином на разных уровнях прохождения; и (c) процент полиплоидных клеток на протяжении оставшейся продолжительности жизни.Начиная с пассажа 23 клеток, культуры обрабатывали колхицином в течение 3 часов на пассажах 26, 36, 46, 56 или 65. Некоторые из культур, обработанных на пассаже 26, также обрабатывали второй раз на пассаже 34 или 44. Четыре параллельные культуры были установлены для каждого лечения и их продолжительности жизни в измеренных пассажах. Результаты представлены в таблице 2. Ни одна из обработанных культур не имела значительного снижения продолжительности жизни; общее небольшое снижение по сравнению с контролем, вероятно, связано с некоторой потерей клеток после обработки колхицином.Слайды для метафазных исследований готовили с интервалами примерно в 10 пассажей от всех обработанных культур и контролей. Количество диплоидов и полиплоидов составило I

    по колхицину

    Клетки обрабатывали на указанных уровнях пассажа, а затем оценивали на полиплоиды с интервалами до прекращения роста. на момент обработки Control

    26

    36

    46

    56

    % Плоиды PolyPassage

    % Плоиды PolyPassage

    % Плоиды PolyPassage

    % Плоиды PolyPassage

    % участки PolyPassage

    % 26+ 4 ”26+ 6 26+ 15 26 + 23 26 + 31

    36-t 1 36 + 11 36 + 19

    46+ 3 46+ 13

    56 + 1

    3.4 4,8 7,1 10,9

    13,8 15,8 17,8 19,1 14,5

    48,5 52,1 51,9

    13,3 15,3

    28,4

    n Общий возраст культуры определяется числом проходов на момент обработки и последующих пассажей. Exp Cell Res I I2 (I 978)

    284

    Томпсон и Холлидей

    Таблица 4. Число хромосом в популяциях клеток, выживших после начальной обработки колхицином. Клон №. 1 2 3 4 5 6

    Пассаж во время клонирования 36: 58 25 i:

    (клоны), полученные от особи

    Процент

    исследованных метафаз

    диплоидов

    Субдиплоидов

    Всего

    полиплоидов Срок службы

    373 761 431 711 587 322

    55.8 77,6 41,8 16,7 46,8 50,9

    8,5 5,7 9,2 8,2 4,6 8,7

    35,7 16,7 49,0 75,1 48,6 40,4

    62 45 54 57 58 53

    n Хромосомные номера. 40-50. * № хромосом. 1540. c № хромосом. 50-100, с (2% клеток с более высокой плоидностью. D Удвоение популяции, рассчитанное по росту одной клетки при проходе через сливную носовую бутыль, плюс добавление последующих субкультур.

    подсчитано с использованием объектива x40. однократное лечение колхицином показано в таблице 3.За исключением клеток, обработанных на 36-м пассаже, в этих экспериментах доля полиплоидов среди выживших после обработки колхицином была ниже, чем полученная в экспериментах в таблице 1. Тем не менее, в каждом случае исходный процент полиплоидии был намного выше, чем в культуре контроля. Что еще более важно, можно ясно видеть, что доля полиплоидных клеток оставалась постоянной на протяжении всей последующей жизни. В контроле доля полиплоидных клеток составляет 3-4% в культурах среднего пассажа, но затем возрастает до 10% в стареющих культурах.Этот результат согласуется с ранее опубликованным [20]. Клонирование

    Была предпринята попытка клонировать некоторые из обработанных колхицином культур, чтобы получить штаммы полиплоидных клеток. Для клонирования использовали две культуры: (1) культуру обрабатывали колхицином на 26-м пассаже и клонировали на 36-м пассаже; и (2) свеже размороженную молодую культуру (пассаж 16) обрабатывали в пассаже 17 и использовали для клонирования Exp Cell Res 112 (I 978)

    в пассаже 18 и пассаже 25. Из 33 выделенных клонов 6 можно было субкультивировать с помощью достаточно длительная процедура расщепления 1: 2, чтобы мы могли проводить хромосомные исследования, а также рассчитывать удвоения клеток отдельных клонов.Клон 1 был выделен из культуры (1) выше, клон 2 из культуры (2) на 18-м пассаже и клоны 3-6 из культуры (2) на пассаже 25. Результаты хромосомных исследований (таблица 4) показывают, что ни один из изолированные клоны содержали только полиплоиды. Это может указывать на то, что клоны не одноклеточного происхождения. Пятьдесят метафаз каждого из штаммов клонированных клеток были детально исследованы при высоком увеличении. Клон 2: из 50 проанализированных метафаз 19 имели эндоредуплицированные хромосомы. Это был единственный клон, показавший эту хромосомную аномалию.Клон 4: у этого клона была самая высокая доля полиплоидов (75%), а также довольно высокая доля субдиплоидов (8%). Вероятно, что этот клон был тетраплоидным по происхождению, но эта сегрегация хромосом привела к образованию диплоидных и субдиплоидных клеток. Martin и Sprague [12] показали, что тетраплоиды спонтанного происхождения могут сегрегировать клетки с более низкими хромо-

    долголетием

    диплоидов и полиплоидными

    некоторыми числами, но у нас нет прямых доказательств этого.Клон 6: в 27 метафазах наблюдались разрывы или другие хромосомные аномалии. Удвоения популяции клонов также приведены в таблице 4. Рассчитанные деления клеток от одиночной клетки до сливного носового флакона добавляются к последующим удвоениям популяции и количеству пассажей во время клонирования. Общая продолжительность жизни клонов находится в пределах нормальных диплоидных культур MRC-5 [9, 191]. Клетки клона 2 имели некоторые морфологические особенности стареющих клеток, например довольно крупные клетки с нерегулярной структурой роста, и этим можно объяснить несколько более короткую продолжительность жизни этого клона.ОБСУЖДЕНИЕ Наши результаты показывают, что блокирование фибробластов в метафазе митоза колхицином приводит к образованию высокой доли полиплоидов, способных к дальнейшей пролиферации. Большинство этих клеток имеют число хромосом в диапазоне тетраплоидов. Поскольку клеточный цикл MRC-5 составляет около 18 часов, а обработка колхицином обычно длилась всего 3 часа, можно было ожидать, что только около 16% клеток перейдут в метафазу. Однако во многих случаях мы восстановили 50% полиплоидов в выжившей популяции.Это указывает на то, что некоторые клетки, которые не переходят в метафазу во время лечения, были чувствительны к колхицину и не выжили. Наши наблюдения за обработанными культурами подтверждают, что многие клетки действительно отделяются от поверхности стекла после обработки колхицином. Популяции, содержащие высокую долю полиплоидных клеток, росли с той же скоростью, что и контрольные культуры, а доля полиплоидов оставалась постоянной. Эти наблюдения приводят к двум важным выводам. (1) Полиплоидные клетки не могут быть нежизнеспособными

    человеческих фибробластов

    285

    , поскольку тогда культуры, содержащие 50% таких клеток, будут расти вдвое медленнее.(2) Если полиплоидные клетки растут, они должны расти с той же скоростью, что и диплоидные. Если бы тот или иной тип клеток рос быстрее, то при длительном пересеве пропорции этих двух типов разошлись бы, но этого не наблюдалось. Поэтому мы можем не учитывать возможность того, что обработка колхицином вызывает нестабильность в диплоидных клетках, что вызывает сегрегацию нежизнеспособных полиплоидов с высокой частотой в течение длительного периода субкультивирования. Для этого степень нестабильности должна быть изначально установлена ​​на заданном уровне, а затем унаследована от многих поколений клеток.Более того, скорость производства полиплоидов должна быть точно компенсирована повышенной скоростью роста родительских диплоидов. Это не означает, что все полиплоидные или диплоидные клетки полностью стабильны. Из предыдущих исследований мы знаем, что нормальные культуры MRCJ продуцируют несколько процентов полиплоидных клеток [10, 201, и Martin & Sprague [12] показали, что тетраплоидные фибробласты кожи продуцируют диплоиды или почти диплоиды с частотой 4-17%. Мы надеялись, что наши наблюдения за клонами дадут конкретную информацию о стабильности.Однако группы фибробластов более склонны к росту, чем отдельные клетки, и поэтому возможно, что наши «клоны» произошли из более чем одной клетки. Тем не менее, один клон содержал 75% полиплоидных клеток, по крайней мере, 20 удвоений популяции после того, как обработанные колхицином клетки были посеяны при низкой плотности, что показывает, что эти клетки должны сохранять значительную степень стабильности. Наиболее важным результатом наших экспериментов является демонстрация того, что полиплоидные клетки не перерастают диплоидные во время фазы старения.Hoehn et al. [6] выделили Exp Cell Res 112 (I 978)

    286

    Thompson and Holliday

    тетраплоидных гибридов из диплоидных фибробластов кожи человека и сообщили, что они имели долговечность, сравнимую с родительскими клетками. Оба эти наблюдения предоставляют убедительные доказательства против теории соматических мутаций клеточного старения. Если мутации накапливаются линейно с кумулятивными делениями клеток, они явно не могут быть выражены в течение длительного периода интенсивного роста (фаза II), который происходит до старения.Следовательно, мутации должны быть в основном рецессивными. Теория основана на предположении, что постепенное увеличение генетической нагрузки рецессивных дефектов приводит в конечном итоге к инактивации по крайней мере одного незаменимого гена на обеих гомологичных хромосомах (полное обсуждение см. В Maynard-Smith [14]). Другая версия теории, предложенная Медведевым [151], заключается в том, что некоторые важные гены существуют в виде множественных копий и постепенно инактивируются до тех пор, пока не останется никаких функциональных копий. В любом случае можно было бы предсказать, что тетраплоидные клетки с вдвое большим количеством копий генов будут способны нести гораздо больше повреждений, чем диплоидные, и, следовательно, будут иметь большую продолжительность жизни.Если вредные мутации будут доминантными, а не рецессивными, они будут отбираться и никогда не будут накапливаться во многих делениях. Предположительно, они могут иметь очень незначительные вредные эффекты, и при условии, что на одно деление клетки происходит более одной такой мутации, они могут накапливаться до тех пор, пока не будет достигнут окончательный критический летальный уровень. Чтобы объяснить аналогичную долговечность диплоидных и тетраплоидных клеток, тогда нужно было бы предположить, что двукратное увеличение частоты мутаций на деление клеток тетраплоидов по сравнению с диплоидами было точно компенсировано двукратным уменьшением вредного воздействия каждой мутации, или критический уровень — у тетраплоидов.Это кажется крайне маловероятным. Exp Cell Res I 12 (1978)

    Наблюдение, что диплоиды и полиплоиды имеют примерно одинаковую продолжительность жизни, совместимо либо с программной теорией старения тибробластов [4,7, 131, либо с теорией ошибок белков [8, 171. В последнем говорится, что начальные события влияют на белки в цитоплазме, но позже, по мере накопления ошибок в ферментативных механизмах репликации и репарации хромосом, также можно ожидать генетических повреждений. Доказательства того, что хромосомы, репликоны, гены и ДНК-полимераза все изменяются во время старения MRC-5, были ранее опубликованы [2, 11, 18, 201.Теория ошибок предсказывает, что дефекты должны накапливаться экспоненциально, и некоторые результаты ясно показывают, что это так [1]. Быстрое накопление генетических повреждений в конце жизни может быть частично вызвано доминантными мутациями, и если это так, то диплоидные и полиплоидные клетки будут одинаково восприимчивы. Это исследование является частью совместной программы с профессором К. Байройтером, Университет офнохенхайма, Штутгарт, которая поддерживается Фондом Фрица Тиссена, Кельн.

    ССЫЛКИ Fulder, S J.Отправлено для публикации. Fulder, SJ & Holliday, R, Cell 6 (1975) 67. Hayflick, L, Exp cell res 37 (1965) 614. — Am j med sci 265 (1973) 433. Hayflick, L & Moorhead, PS, Exp cell res 25 (1961) 585. 6. Hoehn, H, Bryant, EM, Johnston, P, Norwood, TH & Martin, GM, Nature 258 (1975) 609. 7. Holliday, R, Fed proc 34 (1975) 5 1. 8. Холлидей, Р. и Таррант, Г.М., Nature 238 (1972) 26. 9. Холлидей, Р., Хушча, Л.И., Таррант, Г.М., и Кирквуд, Т.Б.Л., Science 198 (1977) 366. 10. Джейкобс, Дж. П., Джонс, С.М. и Бэйли, Дж. П., Nature 227 (1970) 168.11. Linn. С, Кайрис. M & Hollidav. R, Proc natl acad _ sci US 73 (1976) 2818. 12. Мартин, Г.М. и Спраг, Калифорния, Science 166 (1969) _ 761. 13. Мартин, Г.М., Спраг, Калифорния, Норвуд, Т.Н. и Пендерграсс, В.Р., Am j path 74 (1974) 137. 14. Maynard-Smith, J, Procroy sot Lond B 157 (1962) 115. 1. 2. 3. 4. 5.

    Долговечность

    диплоидов и полиплоидов

    15 Медведев З.А., Эксперонтол 1 (1972) 227. 16. Мурхед П.С. и Ноуэлл П.С., Методы и медрес 10 (1964) 310. 17.Orgel, LE, Proc natl acad sci US 49 (1963) 517. 18. Petes, TD, Farber, RA, Tarrant, GM & Holliday, R, Nature 251 (1974) 434.

    человеческих фибробластов

    287

    19. Thompson, KVA & Holliday, R, Exp cell res 80 (1973) 354. 20. — Там же 96 (1975) 1. Получено 7 июля 1977 г. Исправленная версия получена 10 октября 1977 г. Принята 10 ноября 1977 г.

    Exp CellRes 112 ( 1978)

    Тетраплоидный / диплоидный мозаицизм в культивируемых фибробластах кожи гениталий: причинно ли он связан с пеноскротальной гипоспадией? — FullText — Molecular Syndromology 2016, Vol.7, № 3

    Аннотация

    Тетраплоидный / диплоидный мозаицизм — это редкая хромосомная аномалия, о которой нечасто сообщают у пациентов с тяжелой задержкой в ​​развитии, задержкой роста и короткой продолжительностью жизни. Здесь мы представляем 6-летнего пациента с тяжелой пеноскротальной гипоспадией и колобомой левого глаза, но с нормальным ростом, нормальным психомоторным развитием и без дисморфизмов. Мы рассмотрели локальную мозаичную анеуплоидию половых хромосом как возможную причину его генитальной аномалии и провели кариотипирование культивированных фибробластов с кожи гениталий, полученных во время хирургической коррекции.Тетраплоидный / диплоидный (92, XXYY / 46, XY) мозаицизм был обнаружен в 43/57 и 6/26 метафазах в 2 отдельных культурах, соответственно. Клетки буккального мазка, лимфоциты крови и клетки осадка мочи показали диплоидность. Мы исследовали, может ли эта хромосомная аномалия быть обнаружена у других пациентов с тяжелой гипоспадией и кариотипированными генитальными фибробластами у 6 дополнительных пациентов, но обнаружили только низкие частоты (

    © 2016 Автор (ы) Опубликовано S. Karger AG, Базель


    О тетраплоидном мозаицизме очень редко сообщалось у пациентов с врожденными аномалиями, включая задержку роста и задержку развития [Schinzel, 2001].Тетраплоидный мозаицизм также описывается как соматическая хромосомная аномалия при различных состояниях, таких как синдром Гарднера [Danes, 1976], рак [Ganem et al., 2007] и пузырный занос [Sundvall et al., 2013]. Низкие уровни тетраплоидных клеток были обнаружены в лимфоцитах пациентов с синдромом поликистозных яичников [Scarbrough et al., 1984; Rojanasakul et al., 1985], у матери пациента с немозаичной тетраплоидией [Scarbrough et al., 1984] и в десневых клетках пациентов с генерализованным агрессивным пародонтитом [Tözüm et al., 2005; Olgun-Erdemir et al., 2010]. Хотя полиплоидные клетки, включая тетраплоидные клетки, присутствуют in vivo в различных неопухолевых тканях нормальных людей [Biesterfeld et al., 1994], некоторые из опубликованных случаев с низкой частотой тетраплоидных клеток могут представлять собой артефакты культуры [Schinzel, 2001] поскольку диплоидные клетки не могут правильно делиться как in vitro, так и in vivo [Rooney and Czepulkowski, 1992]. Действительно, хорошо известно, что тетраплоидия возникает как артефакт в культурах фибробластов человека с частотой до 5% клеток [Mittwoch et al., 1965; Датчане, 1976 г .; Annerén, 1982], а также в культурах амниоцитов [Sperling, Salig, 1971].

    Тетраплоидный мозаицизм никогда не был связан с гипоспадией. Гипоспадия — распространенный врожденный порок развития мальчиков, встречающийся у ~ 0,3-0,5% живорожденных в западных странах [Баскин, 2004; van der Zanden et al., 2012]. Анатомические исследования эмбриогенеза мышей предполагают, что нарушение слияния, ремоделирования и миграции эпителиальных клеток в уретральной складке приводит к тяжелой гипоспадии [Baskin et al., 2001]. Как экологические, так и генетические факторы вовлечены в этиологию гипоспадии [Carmichael et al., 2012; ван дер Занден и др., 2012; Geller et al., 2014]. Факторы окружающей среды включают осложнения беременности, такие как материнская гипертензия и преэклампсия, тогда как данные о влиянии эндокринных разрушающих агентов во время беременности неубедительны [Carmichael et al., 2012; van der Zanden et al., 2012]. Исследования близнецов и семей подтверждают генетическую основу гипоспадии [van der Zanden et al., 2012]. Полногеномные исследования ассоциации и экспрессии генов указывают на вклад нескольких десятков генов, участвующих в формировании наружных гениталий самцов. К ним относятся гены, кодирующие факторы транскрипции, факторы роста, рецепторы факторов роста и компоненты сигнальных путей, участвующих в формировании паттерна генитального бугорка, а также гены, которые функционируют в синтезе и метаболизме половых гормонов [Li et al., 2006; ван дер Занден и др., 2012; Geller et al., 2014].

    В подавляющем большинстве опубликованных отчетов о генетике гипоспадии использовалась геномная ДНК, выделенная из крови.Мы считали, что локальные мозаичные (половые) хромосомные аномалии, присутствующие в тканях половых органов, в некоторых случаях могут быть связаны с гипоспадией. Поэтому мы кариотипировали фибробласты из биоптатов кожи половых органов, полученных при хирургической коррекции пациента с тяжелой пеноскротальной (задней) гипоспадией. В 2 независимых культурах мы обнаружили тетраплоидные клетки с гораздо большей частотой, чем это могло быть связано с артефактами случайных культур. Мы изучили фибробласты кожи половых органов еще 6 пациентов, чтобы различить исключительную, спорадическую находку у нашего первого пациента и более общую и, возможно, причинную связь между тетраплоидным мозаицизмом и гипоспадией.

    История болезни

    Пациент

    Пациент — шестилетний мальчик чернокожей африканской национальности, которого родители-голландцы усыновили в возрасте 1,5 лет. О его предках ничего не известно. Он был направлен в возрасте 6 лет для хирургической коррекции тяжелой пеноскротальной (задней) гипоспадии. У него были микропенис и яички мошонки (рис. 1), а также колобома радужной оболочки левого глаза (рис. 2). Его рост составлял -0,7 стандартного отклонения, вес +0,2 стандартного отклонения, а OFC — 0 стандартное отклонение. Асимметрии и дисморфизма лица не было.В остальном он был здоров с нормальным психомоторным и интеллектуальным развитием.

    Рис. 1

    Гениталии пациента до ( a ) и после хирургической коррекции ( b ).

    Рис. 2

    Колобома левого глаза ( a ) и нормального правого глаза ( b ).

    Дополнительные пациенты и контрольные лица

    Были включены шесть других пациентов с пеноскротальной гипоспадией в возрасте от 8 месяцев до 9 лет.5 лет. Фибробласты кожи гениталий от 3 пациентов с другими генитальными аномалиями, но без гипоспадии, были использованы в качестве контроля. Фибробласты, культивированные из биопсий руки или ноги у 4 пациентов без генитальных аномалий, но с подозрением на нарушение обмена веществ, служили другим набором контроля.

    Материалы и методы

    Хирургическая процедура

    Вначале была выполнена меатопластика путем разреза по средней линии дистальной уретральной пластинки и поперечного закрытия (процедура Хейнеке-Микулича).Впоследствии была проведена стандартная процедура продвижения мяса и гландулопластики с мобилизацией ткани головки и тубуляризацией вокруг стента размером 12 Френч. Биопсия кожи полового члена была взята на кончике незамкнутой крайней плоти. Впоследствии вскрытая крайняя плоть была реконструирована. Внутренняя и внешняя части крайней плоти были разделены хирургическим путем. Внутренний слой и tunica dartos были закрыты поверх первого слоя. Наконец, внешний слой реконструкции крайней плоти был закрыт вместе с кожей полового члена.

    Клеточная культура, кариотипирование, FISH и анализ SNP-массива

    Культивирование фибробластов и лимфоцитов крови, а также метафазное кариотипирование проводили в соответствии со стандартными процедурами. Биопсии кожи были разрезаны на небольшие кусочки, которые были использованы для двух независимых одновременных культур фибробластов (A и B). Предметные стекла микроскопа для G-бэндинга были изготовлены из первого пассажа обеих культур. Мы использовали FISH на интерфазах для исследования присутствия тетраплоидных клеток в фибробластах и ​​клетках слизистой оболочки рта и в осадке мочи, используя трехцветный FISH с ДНК-зондами Vysis / Abbott для локусов DXZ1, DYZ3 и D18Z1 [Liehr and Claussen, 2002 ].Профилирование числа копий массива SNP и анализ областей гомозиготности выполняли стандартными методами с использованием чипа Exome BeadChip Infinium Human Omni Express (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США). Впоследствии визуализация результатов массива SNP и анализ данных были выполнены с использованием программного обеспечения Nexus 7.5 (BioDiscovery, Лос-Анджелес, Калифорния, США). Эта платформа способна идентифицировать мозаичные выигрыши, потери или химеризм, если они присутствуют по крайней мере в 5% клеток (= 2,5% аллелей). Результаты были классифицированы с помощью программного обеспечения Cartagenia BENCH (Картахения, Лёвен, Бельгия).

    Результаты

    Цитогенетические исследования у нашего пациента

    Цитогенетические данные сведены в таблицу 1. Кариотипирование выявило 57% тетраплоидных метафаз в культуре A (исследовано 100 метафаз) и 19% в культуре B (32 метафазы). После анализа стандартного количества клеток в 32 клетки был сделан вывод о тетраплоидном мозаицизме в обеих культурах; однако количество проанализированных метафаз было увеличено до 100 только в культуре А, тогда как, оглядываясь назад, можно было бы сделать это в обеих культурах.Остальные метафазы имели нормальный мужской кариотип 46, XY. Типичные метафазные распределения обеих культур, показывающие смешение клеток 92, XXYY и 46, XY, показаны на фиг. 3. Поскольку исходная биопсия была полностью использована для инициирования первичных культур, было невозможно исследовать некультивируемые клетки с использованием интерфазной FISH. Поэтому в будущих исследованиях может оказаться полезным сохранить некультивируемый фрагмент кожи для возможного межфазного анализа. Кариотипирование лимфоцитов крови (n = 400), интерфазного FISH клеток слизистой оболочки щеки (n = 100) и клеток осадка мочи (n = 100) соответствовало 46, XY во всех клетках.Чтобы исключить химеризм как причину тетраплоидии, был проведен анализ SNP-массива ДНК, выделенной из клеток в культуре А. Не было получено доказательств наличия дополнительных аллелей, которые могли бы указывать на химеризм (предел обнаружения ~ 5% тетраплоидных клеток).

    Таблица 1

    Резюме цитогенетических данных у пациентов с гипоспадией и контрольной группы

    Рис. 3

    a 92, XXYY метафаза при биопсии кожи половых органов. b Репрезентативные поля из 2 культур фибробластов (верхний и нижний ряд, соответственно), которые были созданы с помощью биопсии гипоспадии нашего первого пациента, демонстрируя мозаицизм диплоидных и тетраплоидных метафаз в обеих культурах.

    Цитогенетические исследования у дополнительных пациентов с гипоспадией и в контроле

    Чтобы повторить обнаружение тетраплоидного мозаицизма у нашего пациента, мы изучили генитальные фибробласты еще 6 пациентов с пеноскротальной гипоспадией. Действительно, тетраплоидные клетки наблюдались, хотя и на гораздо более низком уровне (1-11%). У 3 из этих пациентов (случаи 2, 6 и 7) мы также изучили некультивируемые интерфазные фибробласты и не обнаружили тетраплоидных клеток (данные не показаны). Мы также изучили 2 типа управления.Сначала мы кариотипировали культивированные фибробласты из биоптатов кожи гениталий 3 пациентов мужского пола без гипоспадии, но с другими генитальными аномалиями (таблица 2). Было изучено не менее 100 метафаз, и у этих пациентов также были обнаружены низкие уровни тетраплоидных клеток (1,5, 4 и 5% соответственно). Во-вторых, мы взяли биопсию кожи руки (n = 3) или ноги (n = 1) у мужчин контрольной группы без гипоспадии или каких-либо других генитальных аномалий, а также обнаружили метафазы тетраплоидных фибробластов с частотой, варьирующейся от 1 до 5% (таблица 3). .По сравнению с наивысшим уровнем 5% тетраплоидных метафаз в контроле, сравнимым с более ранними сообщениями других авторов [Mittwoch et al., 1965; Датчане, 1976 г .; Annerén, 1982], частота тетраплоидных метафаз, обнаруженная у нашего пациента, была значительно выше (57%, p <0,00001 и 19%, p = 0,024 соответственно). Максимальная частота 11% тетраплоидии, обнаруженная у других пациентов с гипоспадией, не достигла статистической значимости (p = 0,096).

    Таблица 2

    Биопсия кожи половых органов мужчин без гипопадии

    Таблица 3

    Биопсия кожи руки или ноги мужчин без гипопадии

    Обсуждение

    В этом исследовании мы представляем пациента с пеноскотальной гипоспадией икры колобома левого глаза.Две культуры фибробластов из биопсии кожи полового члена, взятой на кончике незамкнутой крайней плоти, выявили 57 и 19% тетраплоидных клеток, соответственно. По-видимому, процентное содержание тетраплоидных клеток может сильно различаться в разных местах. Поскольку вся биопсия использовалась для инициирования культур фибробластов, было невозможно напрямую продемонстрировать присутствие тетраплоидных клеток в срезах ткани или в некультивированном материале. Однако процентное содержание тетраплоидных клеток значительно выше, чем максимальное количество тетраплоидных клеток (5%) в культивируемых фибробластах контрольных субъектов без гипоспадии, будь то кожа гениталий или кожа рук или ног.Наш пациент может быть исключительным случаем, потому что у других пациентов с гипоспадией мы обнаружили частоту тетраплоидных метафаз от 1 до 11% в биоптатах, взятых во время хирургической коррекции из незамкнутой кожи полового члена. При предположении, что 5% тетраплоидных клеток можно найти в каждой культуре фибробластов, частота 11% тетраплоидных клеток ниже уровня значимости (p = 0,096).

    Учитывая значительный разброс тетраплоидных клеток в разных биопсиях и отсутствие тетраплоидных клеток в интерфазах некоторых других тканей, мы рассматривали артефакт как причину тетраплоидии.Однако есть несколько аргументов против этой гипотезы. Во-первых, за более чем 30 лет, в течение которых было выполнено более 1500 культур фибробластов, мы никогда не наблюдали такого высокого уровня тетраплоидного мозаицизма. Условия культивирования, включая температуру и углекислый газ, всегда поддерживаются на постоянном уровне. По крайней мере, одна параллельная культура от другого пациента не показала тетраплоидных метафаз.

    Тетраплоидия обычно является результатом аберрантного деления клеток (митотическое проскальзывание или нарушение цитокинеза) [Storchova and Kufer, 2008].Анализ массива SNP в фибробластах нашего пациента не дал доказательств наличия дополнительных наборов аллелей. Это исключает химеризм и указывает на то, что дефект клеточного деления также был причиной мозаицизма в этом случае. Этот дефект клеточного деления, в свою очередь, может быть следствием мозаичной мутации одного гена. Например, Ян и др. [2014] продемонстрировали присутствие тетраплоидных клеток в клетках с дефектами одного из генов, участвующих в комплексе 3M, который контролирует целостность микротрубочек.

    Таким образом, хотя присутствие только небольшого процента тетраплоидных клеток в биоптатах кожи полового члена от 6 других пациентов с гипоспадией предполагает, что наш первый пациент представляет собой спорадический, исключительный случай, мы рассматриваем роль тетраплоидного мозаицизма в этиологии гипоспадии не как совершенно невозможно.Во-первых, Стефанова и др. [2010] сообщили об аномалии почек / мочевыводящих путей и / или генитальной неопределенности у 1 из 14 пациентов с тетраплоидным мозаицизмом и у 8 из 10 пациентов с полной тетраплоидией. Во-вторых, анализ биологических путей генов, связанных с гипоспадией, указывает на фибробласты как на тип клеток, имеющий особое значение, поскольку фибробласты играют ключевую роль в закрытии уретральной борозды [Geller et al., 2014]. Мы предполагаем, что смесь диплоидных и тетраплоидных фибробластов в сливающихся эпителиальных краях уретральных складок нарушает нормальное слияние, ремоделирование и миграцию эпителиальных клеток во время закрытия уретральной бороздки [см.Baskin et al., 2001], что приводит к гипоспадии. Это может быть связано со сниженными пролиферативными способностями тетраплоидных клеток, которые возникают из нормальных диплоидных клеток [Storchova and Kuffer, 2008; Ито и др., 2013; Ganem et al. 2014] и, возможно, также из-за нарушенного взаимодействия с соседними клетками, подобно тетраплоидным эндотелиальным клеткам аорты, которые обнаруживают как сниженную скорость роста, так и активацию генов, участвующих в ремоделировании внеклеточного матрикса [Borradaile and Pickering, 2010]. Для дальнейшего подтверждения этих гипотез необходимы дополнительные исследования на других пациентах.

    Недавние исследования на мышах показали, что нарушение рецептора андрогенов генитального бугорка на разных стадиях развития может вызывать гипоспадию, подтверждая, что гипоспадия может быть вызвана дисфункцией молекул на тканевом (мозаичном) уровне [Zheng et al., 2015].

    Альтернативно, возможно, что один или несколько неизвестных факторов предрасполагают как к гипоспадии, так и к тетраплоидии in vitro. Если так, то тетраплоидия скорее будет эпифеноменом.

    Неясно, связана ли колобома радужки нашего пациента с тетраплоидным мозаицизмом, поскольку такая аномалия была зарегистрирована только один раз у другого пациента с тетраплоидным мозаицизмом [Witwer and Witwer, 1985] и у 2 из 10 пациентов с полной тетраплоидией [ Стефанова и др., 2010].

    У пациентов с гипоспадией исследования с использованием урогенитальной биопсии проводились редко. Следовательно, тетраплоидный мозаицизм может быть недооцененным признаком гипоспадии и, возможно, других врожденных аномалий мочеполовых путей. В последние годы классическое кариотипирование все чаще заменяется технологией массивов (array-CGH, ​​SNP-array) и секвенированием следующего поколения (то есть секвенированием всего экзома и секвенированием всего генома) в качестве диагностических инструментов у пациентов с множественными врожденными аномалиями и / или умственная отсталость [Kloosterman, Hochstenbach, 2014].Несмотря на свою диагностическую силу, эти подходы не подходят для выявления нехимерного тетраплоидного мозаицизма. Более того, очевидно, что применение этих методов к ДНК, полученной из лимфоцитов, не позволяет обнаруживать аномалии, присутствующие только в других тканях. Следовательно, наши данные показывают, что может быть полезно проводить генетические исследования в других тканях, помимо крови, и что нехимерная (мозаичная) тетраплоидия может быть выявлена ​​кариотипированием, но не методами на основе массивов. Кроме того, с помощью других современных молекулярных методов без демонстрации общего количества ДНК на клетку, таких как секвенирование следующего поколения, нехимерная (мозаичная) тетраплоидия не может быть идентифицирована.

    Благодарности

    Мы хотели бы поблагодарить доктора Мартина Пута за его конструктивную критику, технических специалистов лаборатории цитогенетики за их экспертную помощь, а также доктора Вигарда Клоостермана и доктора Зусанну Сторчову за обсуждение.

    Заявление об этике

    У авторов нет этических конфликтов, которые следует раскрывать.

    Заявление о раскрытии информации

    Авторы не заявляют о конфликте интересов.

    Список литературы

    1. Аннерен Дж .: Повышенная частота тетраплоидии в культивированных фибробластах кожи конечностей с уменьшением пороков развития.Наследие 96: 255-259 (1982).
    2. Баскин Л.С.: Гипоспадия. Adv Exp Med Biol 545: 3-22 (2004).
    3. Baskin LS, Erol A, Jegatheesan P, Li Y, Liu W, Cunha GR: Формирование уретрального шва и гипоспадия.Cell Tissue Res 305: 379-387 (2001).
    4. Бистерфельд С., Геррес К., Фишер-Вайн Г., Бёкинг А. Полиплоидия в неопухолевых тканях. J Clin Pathol 47: 38-42 (1994).
    5. Боррадайл Н.М., Пикеринг Дж. Г.: Полиплоидия нарушает функцию эндотелиальных клеток аорты человека и предотвращается никотинамидфосфорибозилтрансферазой.Am J Physiol Cell Physiol 298: C66-C74 (2010).
    6. Кармайкл С.Л., Шоу Г.М., Ламмер Э.Дж.: Экологические и генетические факторы, влияющие на гипоспадию: обзор эпидемиологических данных. Врожденные дефекты Res A Clin Mol Teratol 94: 499-510 (2012).
    7. Датчанин Б.С.: Синдром Гарднера: повышенная тетраплоидия в культивированных фибробластах кожи.J Med Genet 13: 52-56 (1976).
    8. Ганем Н.Дж., Сторчова З., Пеллман Д.: Тетраплоидия, анеуплоидия и рак. Curr Opin Genet Dev 17: 157-162 (2007).
    9. Ганем Нью-Джерси, Корнилс Х., Чиу С.И., О’Рурк К.П., Арно Дж. И др.: Неудача цитокинеза запускает активацию пути супрессора опухоли гиппопотама.Ячейка 158: 833-848 (2014).
    10. Geller F, Feenstra B, Carstensen L, Pers TH, van Rooij IALM и др.: Полногеномный ассоциативный анализ выявляет варианты в генах развития, связанных с гипоспадией. Нат Генет 46: 957-963 (2014).
    11. Ито Х, Ога А, Фуруя Т., Икемото К., Амакава Г. и др.: Выяснение пролиферативной способности мононуклеарных тетраплоидных клеток, спонтанно возникающих из диплоидных клеток, с использованием цитометрии изображений и флуоресцентной гибридизации in situ.Цел Пролиф 46: 356-363 (2013).
    12. Клоостерман В.П., Хохстенбах Р.: Расшифровка патогенных последствий хромосомных аберраций при генетических заболеваниях человека. Mol Cytogenet 7: 100 (2014).
    13. Ли Дж., Уиллингем Э., Баскин Л.С.: Профили экспрессии генов в развитии уретры мышей.BJU Int 98: 880-885 (2006).
    14. Liehr T, Claussen U: FISH на препаратах хромосом периферической крови, в Rautenstrauss B, Liehr T (eds): FISH Technology, pp 73-81 (Springer, Berlin 2002).
    15. Mittwoch U, Lele KP, Webster WS: Синтез дезоксирибонукейной кислоты в культивируемых клетках человека и его влияние на концепции эндоредупликации и полиплоидии.Nature 208: 242-244 (1965).
    16. Olgun-Erdemir E, Yildirim RS, Karşiyaka M: Генерализованный агрессивный перидонтит у ребенка с мозаицизмом 92, XXYY / 46, XY: отчет о втором случае. Turk J Pediatr 52: 94-96 (2010).
    17. Рожанасакул А.К., Густавсон Х., Лителл Х., Нилиус С.Дж.: Тетраплоидия у двух сестер с синдромом поликистозных яичников.Clin Genet 27: 167-174 (1985).
    18. Руни Д.Е., Чепулковски Б.Х. (ред.): Цитогенетика человека: практический подход, том I, Конституционный анализ (IRL Press, Oxford 1992).
    19. Scarbrough PR, Hersch J, Kukolich MK, Carrol AJ, Finley SC, et al: Tetraploidy: отчет о трех живорожденных младенцах.Am J Med Genet 19: 29-37 (1984).
    20. Шинцель А: Каталог несбалансированных хромосомных аберраций у человека, изд 2 (Де Грюйтер, Берлин, 2001).
    21. Сперлинг К., Салинг Э: Пренатальный хромосомный анализ с мозаичным утверждением 46, XX-92, XXXX.Возможность ошибочного диагноза [на немецком языке]. Humangenetik 11: 139-145 (1971).
    22. Стефанова И., Джендерни Дж., Каминский Е., Маннхардт А., Майнеке П. и др.: Мозаика и полная тетраплоидия у живорожденных: два новых пациента и обзор литературы. Clin Dysmorphol 19: 123-127 (2010).
    23. Сторчова З., Куффер С. Последствия тетраплоидии и анеуплоидии. J Cell Sci 121: 3859-3866 (2008).
    24. Сундвалл Л., Лунд Х., Ниманн И., Йенсен У., Болунд Л., Сунде Л.: Тетраплоидия пузырно-заносных родинок.Hum Reprod 28: 2010-2020 (2013).
    25. Tözüm TF, Berker E, Akincibay H, Ozer O, Aktaş O, et al: Тетраплоидный / диплоидный мозаицизм с генерализованным агрессивным перидонтитом. J. Peridontol 76: 1567-1571 (2005).
    26. van der Zanden LF, van Rooij IALM, Feitz WFJ, Franke B, Knoers NVAM, Roeleveld N: Этиология гипоспадии: систематический обзор генов и окружающей среды.Обновление Hum Reprod 18: 260-283 (2012).
    27. Witwer BB, Witwer HB: Информация о диплоидно-тетраплоидном мозаицизме у шестилетнего мальчика. Clin Genet 28: 567-568 (1985).
    28. Ян Дж., Ян Ф., Ли З., Синнот Б., Каппелл К.М. и др.: Комплекс 3М поддерживает целостность микротрубочек и генома.Mol Cell 54: 791-804 (2014).
    29. Zheng Z, Armfield BA, Cohn MJ: Время разрушения рецепторов андрогенов и воздействия эстрогенов лежит в основе спектра врожденных аномалий полового члена. Proc Natl Acad Sci USA 112: E7194-E7203 (2015).

    Автор Контакты

    Жак К.Гилтай, доктор медицинских наук

    Отделение медицинской генетики, Университетский медицинский центр Утрехта

    Почтовый ящик 85090

    NL-3508 AB Утрехт (Нидерланды)

    Электронная почта [email protected]


    Подробности статьи / публикации

    Предварительный просмотр первой страницы

    Одобрена: 29 марта 2016 г.
    Опубликована онлайн: 2 июня 2016 г.
    Дата выпуска: июль 2016 г.

    Количество страниц для печати: 7
    Количество рисунков: 3
    Количество столов: 3

    ISSN: 1661-8769 (печатный)
    eISSN: 1661-8777 (онлайн)

    Для дополнительной информации: https: // www.karger.com/MSY


    Лицензия открытого доступа / Дозировка лекарства / Заявление об ограничении ответственности

    Эта статья находится под международной лицензией Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 (CC BY-NC-ND). Использование и распространение в коммерческих целях, а также любое распространение измененных материалов требует письменного разрешения. Дозировка лекарств: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор и дозировка лекарств, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации.Однако ввиду продолжающихся исследований, изменений в правительственных постановлениях и постоянного потока информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на них, читателю настоятельно рекомендуется проверять листок-вкладыш для каждого препарата на предмет любых изменений показаний и дозировки, а также дополнительных предупреждений. и меры предосторожности. Это особенно важно, когда рекомендованным агентом является новое и / или редко применяемое лекарство. Отказ от ответственности: утверждения, мнения и данные, содержащиеся в этой публикации, принадлежат исключительно отдельным авторам и соавторам, а не издателям и редакторам.Появление в публикации рекламы и / или ссылок на продукты не является гарантией, одобрением или одобрением рекламируемых продуктов или услуг или их эффективности, качества или безопасности. Издатель и редактор (-ы) не несут ответственности за любой ущерб, причиненный людям или имуществу в результате любых идей, методов, инструкций или продуктов, упомянутых в контенте или рекламе.

    Полиплоидия полуклонированных эмбрионов, полученных из партеногенетических гаплоидных эмбриональных стволовых клеток

    Abstract

    У млекопитающих слияние двух гамет, ооцита и сперматозоида, во время оплодотворения формирует тотипотентную зиготу.Не было зарегистрировано случаев развития взрослых млекопитающих в результате естественного партеногенеза, при котором эмбрионы развиваются из неоплодотворенных ооцитов. Геном и эпигенетическая информация гаплоидных гамет имеют решающее значение для развития млекопитающих. Гаплоидные эмбриональные стволовые клетки (haESC) могут быть получены из однопородных бластоцист и обладают только одним набором хромосом. Предыдущие исследования показали, что геном сперматозоидов или ооцитов можно заменить на haESC с манипуляцией геномного импринтинга или без него для генерации мышей.Недавно эти замечательные методы полуклонирования были применены для скрининга ключевых факторов эмбрионального развития мышей. Хотя haESCs применялись в качестве заменителей гаметических геномов, фундаментальный механизм того, как haESCs вносят вклад в геном тотипотентных эмбрионов, неясен. Здесь мы показываем создание фертильных полуклонированных мышей путем инъекции партеногенетических haESC (phaESC) в ооциты после делеции двух дифференциально метилированных областей (DMR), IG -DMR и h29 -DMR.Для дальнейшей характеристики генома полуклонированных эмбрионов мы создали линии ESC из полуклонированных бластоцист. Мы сообщаем, что полиплоидные кариотипы наблюдаются в полуклонированных ESC (scESC). Наши результаты подтверждают, что митотически арестованные phaESC дают полуклонированные эмбрионы и мышей при удалении IG -DMR и h29 -DMR. Кроме того, мы подчеркиваем возникновение полиплоидии, которую необходимо учитывать для дальнейшего улучшения развития полуклонированных эмбрионов, полученных с помощью инъекции haESC.

    Образец цитирования: Aizawa E, Dumeau C-E, Freimann R, Di Minin G, Wutz A (2020) Полиплоидия полуклонированных эмбрионов, полученных из партеногенетических гаплоидных эмбриональных стволовых клеток. PLoS ONE 15 (9): e0233072. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233072

    Редактор: Джон Скурлеммер, Институт Арагонес де Сьенсиас де ла Салуд, ИСПАНИЯ

    Поступила: 26 апреля 2020 г .; Одобрена: 25 августа 2020 г .; Опубликовано: 10 сентября 2020 г.

    Авторские права: © 2020 Aizawa et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.

    Финансирование: AW, грант 31003A_152814 / 1 Швейцарского национального научного фонда, ВЕБ-страница: www.snf.ch Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. .

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

    Введение

    Генетическая информация ооцита и сперматозоида передается потомству. И материнский, и отцовский геномы необходимы для нормального развития эмбрионов млекопитающих. Напротив, однородные эмбрионы страдают дефектами развития из-за дисбаланса геномного импринтинга [1]. Несмотря на важность гаметического генома, предпосылки для формирования тотипотентной зиготы остаются не совсем понятными.На мышах предыдущие исследования показали, что две дифференциально метилированные области в кластерах импринтированных генов h29-Igf2 и Gtl2-Dlk1 вносят критический вклад в геном эмбрионов [2, 3]. Обе области обычно метилированы и неметилированы на отцовских и материнских хромосомах, соответственно. Делеция h29 -DMR и Gtl2-Dlk1 межгенного DMR, полученного из зародышевой линии ( IG -DMR), приводила к потере экспрессии h29 и Gtl2 материнского аллеля соответственно [4, 5 ].Делеция h29 -DMR или комбинированные делеции h29 — и IG -DMR из генома нерастущих ооцитов способствовали образованию бимернальных мышей после инъекции в зрелые ооциты [2, 3]. Эти исследования определили стратегию замещения сперматозоидов материнским геномом. Недавние исследования также изучали возможность замены гаметического генома гаплоидными эмбриональными стволовыми клетками мыши (haESC). Гаплоидные ЭСК представляют собой уникальные линии стволовых клеток, созданные либо из партеногенетических [6, 7], либо из андрогенетических гаплоидных бластоцист [8, 9].Гаплоидные ЭСК обладают одним набором хромосом, который у мышей содержит 20 хромосом, похожих на гаметы. Благодаря своей уникальной гаплоидии, haESC нашли свое применение в недавних исследованиях оригинальными способами. Одно из приложений — генетический скрининг. В то время как гетерозиготные мутации в диплоидных клетках часто фенотипически маскируются, гемизиготные мутации в гаплоидных клетках напрямую выражают фенотипы. Например, векторы-ловушки для генов использовались для скрининга генов, необходимых для выявления химической токсичности, самообновления ESC и инактивации Х-хромосомы [6, 10–12].Другое важное применение haESC основано на сходстве их гаплоидного генома с гаметическим геномом. В нескольких сообщениях продемонстрирована возможность замены генома сперматозоидов отцовского происхождения либо на андрогенетический haESC (ahaESC), либо на партеногенетический haESC (phaESC) для получения полуклонированных мышей [8, 9, 13, 14]. Кроме того, было продемонстрировано, что геном ооцита может быть заменен геномом phaESC для создания полуклонированных мышей, хотя и с низкой частотой [15].В отличие от ооцитов и сперматозоидов, генетические мутации могут быть легко введены в haESC благодаря их способности к самообновлению в культуре. Методы введения генетических модификаций в зародышевую линию с помощью haESC являются важным подходом для изучения эмбрионального развития и создания трансгенных животных. Недавние исследования также объединили редактирование генома на основе CRISPR-Cas9 с haESC для генетического скрининга [16], характеристики импринтирующих областей для эмбрионального развития [17] и идентификации важных аминокислот в белке DND1 для развития первичных зародышевых клеток [18]. .

    В то время как эти замечательные исследования успешно применили haESCs в качестве заменителей гаметических геномов, механизм того, как haESCs вносят вклад в геном тотипотентных эмбрионов, еще предстоит выяснить. Например, геномы сперматозоидов и haESC принципиально различаются, поскольку большая часть генома сперматозоидов упакована протаминами, но хромосомы haESC имеют обычную нуклеосомную структуру. Правильная сегрегация материнских и отцовских наборов гаплоидных хромосом в каждом бластомере необходима при первом делении зиготы для формирования компетентного в развитии двухклеточного эмбриона.В противном случае у эмбрионов возникают дефекты развития из-за анеуплоидии или полиплоидии [19]. Полиплоидия описывает геномы с более чем двумя полными наборами хромосом и наблюдается у нескольких видов, включая растения и дрожжи [20]. У млекопитающих полиплоидные эмбрионы могут возникать в результате полиспермии или аномальной сегрегации хромосом, но обнаруживают дефекты развития и задержку [20-24].

    В этом исследовании мы сообщаем о создании здоровых мышей путем инъекции митотически арестованных phaESC, которые несут делеции h29 — и IG -DMR в ооциты в метафазе II (MII).Мы создали полуклонированные ESC (scESC) из полуклонированных бластоцист для дальнейшей характеристики их генома. Мы обнаружили, что несколько scESC демонстрируют полиплоидию, что указывает на необходимость осторожного анализа для изучения полуклонированных эмбрионов, полученных путем инъекции haESC.

    Результаты

    Удаление

    IG -DMR и h29 -DMR в линиях haESC

    В предыдущем исследовании сообщалось, что бимернальные эмбрионы, полученные заменой отцовского генома сперматозоидов гаплоидным геномом нерастущих ооцитов, обнаруживают дефекты развития и остановку эмбриогенеза [25].Эти дефекты в значительной степени были преодолены с помощью манипуляции с геномным импринтингом. Делеция IG — и h29 -DMR из генома нерастущих ооцитов привела к развитию бимернальных мышей [2, 3]. Эти исследования показывают, что экспрессия импринтированного гена, регулируемая IG -DMR и h29 -DMR, является ключевым барьером, который предотвращает развитие двупернальных эмбрионов.

    Чтобы управлять геномным импринтингом в phaESC, систему CRISPR-Cas9 использовали для удаления IG -DMR и h29 -DMR в линии phaESC, которая была создана из ооцита мыши 129S6 / SvEvTac (рис. 1A и S1A. и S1B фиг.).После трансфекции векторами экспрессии для нуклеаз CRISPR-Cas9 и направляющих РНК, плазмиды транспозона piggyBac для экспрессии EGFP и вектора экспрессии для транспозазы piggyBac отдельные клетки помещали в многолуночные чашки для создания клональных культур. 2 линии phaESC с двойным нокаутом, DKO-phaESC-1 и DKO-phaESC-2, были идентифицированы генотипированием на основе ПЦР (S1C фиг.). Эти линии DKO-phaESC также экспрессировали EGFP, что позволило проанализировать их вклад в развитие эмбрионов в дальнейших исследованиях.Секвенирование ДНК подтвердило делеции 4168 пар оснований (п.о.) в IG -DMR как для DKO-phaESC-1, так и для DKO-phaESC-2 (рис. 1B). Точно так же делеции 3908 и 3927 п.н. в h29 -DMR были подтверждены в DKO-phaESC-1 и DKO-phaESC-2, соответственно. Обе линии ESC показали типичную морфологию ESC, сравнимую с таковой у родительской линии phaESC (рис. 1C). Неповрежденный гаплоидный кариотип был подтвержден анализом распределения метафазных хромосом (рис. 1D).

    Рис. 1. Генерация делеций IG -DMR и h29 -DMR в haESC.

    (A) IG -DMR и h29 -DMR делеции были сконструированы в phaESC, которые были созданы из гаплоидных бластоцист, полученных из активированных ооцитов мыши, путем одновременной трансфекции четырьмя векторами, кодирующими нуклеазы CRISPR-Cas9, CAG-EGFP. -IRES-hygro piggyBac транспозонный вектор и транспозазный вектор. (B) Последовательности фрагментов ПЦР, амплифицированных над удаленными областями, подтвердили потерю обоих DMR в DKO-phaESC-1 и DKO-phaESC-2. (C) Морфология линий DKO-phaESC.Шкала 200 мкм. (D) Гаплоидные кариотипы наблюдались как в DKO-phaESC-1, так и в DKO-phaESC-2. (E) Транскрипция импринтированных генов Gtl2 и h29 , оба из которых матерински экспрессируются и регулируются с помощью IG — и h29 -DMR, была снижена в DKO-phaESC-1 и DKO-phaESC-2. . Экспрессия гена была нормализована до Gapdh относительно родительской клеточной линии. Данные представляют собой относительное выражение каждого образца со средними значениями и стандартным отклонением (n = 4).**** P <0,0001; ** P <0,01; нс, не имеет значения.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233072.g001

    Материнский экспрессируемый ген Gtl2 отображается в большой импринтированный кластер на хромосоме 12 мыши и регулируется отцовским метилированным IG -DMR [26 ]. Ген h29 , экспрессируемый матерью, картирован близко к экспрессируемому отцовски гену Igf2 на хромосоме 7 и регулируется общим h29 -DMR.Как и ожидалось, транскрипция Gtl2 и h29 была потеряна в обеих линиях DKO-phaESC (фиг. 1E). Кроме того, экспрессия отцовского экспрессированного гена Dlk1 была немного снижена в DKO-phaESC-1 и DKO-phaESC-2 по сравнению с экспрессией родительской линии phaESC. Не наблюдалось значительной разницы в экспрессии отцовского экспрессированного гена Igf2 .

    Получение полуклонированных эмбрионов и scESC путем инъекции DKO-phaESC в ооциты

    Для оценки потенциала DKO-phaESCs в качестве замены сперматозоидов мы вводили отдельные клетки в ооциты MII, которые были получены от самок B6D2F1 после суперовуляции (рис. 2А).Ранее ahaESCs, которые были задержаны в митозе в M-фазе при лечении демеколцином, использовались в качестве заменителя сперматозоидов с большей эффективностью, чем ahaESCs в G0- или G1-фазе [9]. Демеколцин связывается с неполимеризованным тубулином и ингибирует полимеризацию микротрубочек, что приводит к остановке клеточного цикла в митозе без образования веретена [27]. Мы обработали DKO-phaESC-2 демеколцином и очистили популяции 2n с задержанными метафазами путем сортировки клеток (рис. 2В). Затем конструировали полуклонированные эмбрионы путем инъекции клеток DKO-phaESC-2 в M-фазе в ооциты MII с последующей активацией хлоридом стронция.После активации у большинства полуклонированных эмбрионов наблюдалась слабая флуоресценция EGFP, распределенная по цитоплазме. В небольшом количестве эмбрионов была очевидна единственная круглая область интенсивной флуоресценции EGFP (рис. 2C), что указывало на то, что плазматическая мембрана DKO-phaESC случайно осталась неповрежденной во время инъекции. Полуклонированные эмбрионы были впоследствии культивированы in vitro и развиты до стадии 2 клеток и бластоцисты с частотой 58,7% (98/167) и 12,6% (21/167), соответственно.На 2-клеточной стадии экспрессия EGFP была незначительной или отсутствовала (Таблица 1). Экспрессия EGFP начиналась постепенно со стадии 4 клеток на 2 день после инъекции. Наконец, все бластоцисты проявляли экспрессию EGFP, что указывает на то, что DKO-phaESC вносят вклад в геном бластоцисты и не развиваются партеногенетические бластоцисты.

    Рис. 2. Характеристика линий scESC, полученных путем инъекции DKO-phaESC в ооциты.

    (A) Схема генерации линий scESC путем инъекции DKO-phaESCs в ооциты MII.(B) DKO-phaESC были арестованы в метафазе с помощью демеколцина в течение 8 часов и отсортированы на содержание 2n ДНК. Пик интенсивности Hoechst, соответствующий 2n DKO-phaESC, отмечен звездочкой. (C) Развитие полуклонированного эмбриона после инъекции DKO-phaESCs в ооциты. Показаны флуоресценция EGFP, объединенная с изображениями в светлом поле. На 4-й день морулы превратились в бластоцисты. Шкала 200 мкм. (D, E) Анализ содержания ДНК в 4 линиях scESC, которые были либо необработанными (D), либо обработанными демеколцином (E), методом проточной цитометрии после окрашивания по Hoechst.(D) Содержание ДНК в фазе G1 scESC-1 и scESC-3 появилось посередине между содержанием ДНК диплоидных ESC, контролирующих фазу G1 и G2, что указывает на то, что scESC-1 и scESC-3 являются триплоидными. scESC-4 содержал как диплоидные, так и тетраплоидные клетки. (E) Только одна популяция содержания ДНК наблюдалась в каждом scESC-1, scESC-2 и scESC-3, тогда как scESC-4 показал две популяции с различным содержанием ДНК. Гаплоидно-диплоидная смешанная линия ESC и диплоидная линия ESC были включены в качестве эталона (вверху). Процент ячеек внутри пиков указан на гистограммах (вверху и внизу).(F) Метафазные спреды показывают триплоидные кариотипы scESC-1 и scESC-3 и тетраплоидный кариотип scESC-4.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233072.g002

    Для дальнейшего анализа полуклонированных эмбрионов мы культивировали 5 полуклонированных бластоцист и создали 4 полуклонированных линии ESC, от scESC-1 до scESC- 4 (S2A рис.). Генотипирование показало, что эти линии scESC обладают как диким типом, так и удаленными аллелями IG -DMR и h29 -DMR, подтверждая вклад DKO-phaESC и геномов ооцитов (S2B фиг.).Затем мы проанализировали содержание ДНК всех 4 линий scESC с помощью проточной цитометрии после окрашивания Hoechst (рис. 2D). Кроме того, содержание ДНК в линиях scESC с задержкой в ​​М-фазе анализировали после обработки демеколцином в течение 8 часов (фиг. 2E). scESC-2 показал ожидаемое содержание диплоидной ДНК, тогда как другие 3 линии scESC оказались полиплоидными. Все клетки в scESC-1 и scESC-3 показали содержание триплоидной ДНК. scESC-4 содержал клетки с содержанием диплоидной и тетраплоидной ДНК в соотношении 86,4% и 11.6% соответственно. Анализ метафазных хромосом подтвердил триплоидный кариотип в scESC-1 и scESC-3 и тетраплоидный кариотип в scESC-4 (рис. 2F). Учитывая, что полиплоидия несовместима с развитием мышей [21-24], это наблюдение может иметь отношение к улучшению полуклонирования с помощью инъекции phaESC.

    Получение полуклонированных мышей из полуклонированных эмбрионов

    Для дальнейшего анализа полуклонированных эмбрионов мы выполнили перенос эмбрионов для получения полуклонированных мышей.Сконструированные полуклонированные эмбрионы культивировали до 2-клеточной стадии и переносили в яйцеводы псевдобеременных самок Swiss Webster. Мы выбрали реципиентов Swiss Webster из-за их цвета шерсти альбиноса, который легко отличить от цвета шерсти агути ооцитов phaESC и B6D2F1. Параллельно с этим были получены двухклеточные эмбрионы-альбиносы от мышей Swiss Webster путем оплодотворения in vitro (ЭКО) в качестве технического контроля. Всего 39 полуклонированных и 20 контрольных двухклеточных эмбрионов были перенесены 4 самкам-реципиентам (таблица 2).Две из четырех самок-реципиентов сохранили беременность и родили 6 детенышей (обозначенные F0 №1-6) и 1 детеныша (F0 №7) (рис. 3A). F0 нет. 6 и 7 имели темную пигментацию глаз, а биопсия пальцев стопы показала экспрессию EGFP при УФ-освещении (рис. 3B). Генотипирование подтвердило, что F0 нет. 6 и 7 были самками и гетерозиготными по IG -DMR и h29 -DMR, несущим аллели дикого типа и делеционные аллели (рис. 3C). Обе мыши росли нормально, без каких-либо явных фенотипов или проблем со здоровьем. Кроме того, они были фертильными и родили доношенных детенышей F1 при вязке с самцами Swiss Webster (рис. 3D).Передача трансгена EGFP наблюдалась примерно у половины этих мышей F1 (7/15) в ожидаемом менделевском соотношении (S3 фиг.). Секвенирование бисульфитной ДНК показало, что F0 нет. 6 и 7 несли как метилированные, так и неметилированные аллели DMR трех импринтированных генов Kcnq1 , Igf2r и Peg13 (рис. 3E). Kcnq1 из F0 № 6 и Igf2r из F0 № 6 и 7 оказались слегка гиперметилированными по сравнению с контрольной самкой мыши B6D2F1. Напротив, Peg13 был менее метилирован в F0 №.6 и 7, чем в контроле. Учитывая, что мы наблюдали несколько повышенный уровень метилирования в контроле, который был сопоставим с таковым в F0 no. 6 и нет. 7, мы предполагаем, что метилирование 3 импринтированных генов, которые мы исследовали, было в пределах нормы у 2 полуклонированных мышей. Эта точка зрения согласуется с нашим наблюдением, что полуклонированные мыши были здоровыми и плодовитыми.

    Рис. 3. Получение полуклонированных мышей путем переноса полуклонированных эмбрионов матерям-реципиентам.

    (A) 7 потомков (F0 no.1–7) были получены от 2 матерей-реципиентов-альбиносов после переноса полуклонированных и контрольных двухклеточных эмбрионов-альбиносов. F0 нет. 6 (обозначено звездочкой) и нет. 7 — черные глаза и цвет шерсти агути, указывающий на пигментацию, происходящую от DKO-phaESC. (B) Биопсия пальца стопы F0 № 1–7. Биопсии F0 нет. 6 и 7 экспрессировали EGFP при УФ-освещении. (C) Генотипирование F0 № 1–7. F0 нет. 6 и 7 обладали аллелями дикого типа и делециями IG -DMR и h29 -DMR. (D) Спаривание полуклонированных F0 No.6 и 7 с самцами дикого типа дали здоровых детенышей F1 (обозначены звездочкой). (E) Анализ метилирования ДНК бисульфитом Kcnq1 , Igf2r и Peg13 в биоптатах F0 и контрольной мыши. Белые кружки представляют неметилированные CpG; черные кружки представляют собой метилированные CpG. Соотношение метилированных CpG показано в скобках.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233072.g003

    Обсуждение

    Успешное получение полуклонированных мышей в нашем исследовании показывает, что phaESC с делециями IG -DMR и h29 -DMR могут заменять сперматозоиды в развитии мыши.Мы неожиданно обнаружили, что некоторые линии scESC, которые мы получили из полуклонированных эмбрионов, были триплоидными или содержали смесь диплоидных и тетраплоидных клеток (рис. 2D – 2F). Можно рассмотреть несколько причин полиплоидных геномов полуклонированных эмбрионов.

    Одной из возможных причин является неспособность экструдировать один гаплоидный геном либо из веретена ооцита MII, либо из DKO-phaESC, задержанного в М-фазе, после конструирования полуклонированного эмбриона. Следуя предыдущему исследованию [9], мы использовали DKO-phaESC, задержанные в М-фазе обработкой демеколцином, в качестве донорских клеток для полуклонированных эмбрионов.Поскольку демеколцин ингибирует полимеризацию микротрубочек, образование митотических веретен, по-видимому, блокируется в DKO-phaESC, когда они вводятся в ооциты MII. Возможно, что ошибочная сборка веретена или ошибочное прикрепление хромосом M-фазы DKO-phaESC к веретену после инъекции в ооциты могли вызвать дефекты сегрегации хромосом. Полиплоидия также могла возникнуть, если длительное лечение демеколцином приводило к диплоидизации DKO-phaESC. Возможно, что некоторые DKO-phaESCs могут выйти из митотического ареста и войти в фазу G1 без сегрегации хромосом и цитокинеза.Однако мы считаем это маловероятным. Наконец, процедура инъекции могла вызвать ошибки в веретене MII ооцита. В этих трех сценариях 2n хроматиды либо ооцита MII, либо DKO-phaESC будут вносить вклад в эмбрион, приводя к триплоидному геному.

    Смешанный кариотип диплоидии и тетраплоидии также наблюдался в одной линии scESC. Объяснить это труднее. Смешанный кариотип мог возникнуть из-за ошибочной сегрегации хромосом при 2-м или более позднем делении расщепления [28].Альтернативно, тетраплоидия могла возникнуть во время или после образования scESC. Однако мы думаем, что это маловероятно, учитывая, что мышиные ESC стабильно поддерживают нормальный диплоидный геном, и процедура инъекции вряд ли повлияет на образование ESC, которое было начато через 4 дня. Мы поддерживаем интерпретацию, согласно которой как диплоидные, так и тетраплоидные клетки могли развиться в полуклонированном эмбрионе. Несколько исследований химерных бластоцист, содержащих диплоидные и тетраплоидные эмбриональные клетки, показали, что тетраплоидные клетки вносят вклад во внеэмбриональные ткани, но редко в плод [29–31].Тем не менее, было сообщение о том, что тетраплоидные эмбрионы развились до бластоцист и сформировали зародыши после имплантации [22]. Принимая во внимание эти результаты, возможно, что тетраплоидные клетки развились до клеток внутренней клеточной массы бластоцисты, и как диплоидные, так и тетраплоидные scESCs были получены в одной из 4 линий в нашем исследовании. Неожиданное наблюдение полиплоидии в нескольких линиях scESC, возможно, является препятствием для развития полуклонированных мышей и может быть целью улучшений, направленных на повышение урожайности нормальных полуклонированных эмбрионов в будущем [21-24].Ожидается, что дальнейшие исследования выявят механизм полиплоидии у полуклонированных эмбрионов.

    Применение haESC для замены гаметических геномов имеет потенциал для генетики, поскольку мутации могут быть эффективно введены в haESC, в отличие от ооцитов и сперматозоидов. Мы демонстрируем, что 2 DMR могут быть удалены за один шаг в haESC с сохранением гаплоидного кариотипа. Создание трансгенных эмбрионов или мышей путем замены гаметических геномов на haESC может быть особенно полезным для аллель-специфического анализа и для изучения геномного импринтинга.haESC могут быть инструментом генетического скрининга факторов, необходимых для оплодотворения или эмбриогенеза, путем инъекции генетически модифицированных haESC в ооциты. На сегодняшний день в замечательных исследованиях сообщается о применении этой технологии haESC для генетического скрининга [16–18]. Механизм, с помощью которого haESCs вносят вклад в полуклонированные эмбрионы, остается важным объектом дальнейших исследований. Наблюдение за полиплоидией полуклонированных эмбрионов в нашем исследовании подчеркивает, что дальнейшее понимание механизма влияния haESC на полуклонированные эмбрионы необходимо для лучшего понимания адаптации гаметического генома и повышения эффективности полуклонирования.

    Материалы и методы

    Животные и эксперименты

    мышей C57BL / 6J и DBA / 2J были приобретены в Charles River Laboratories (Уилмингтон, США). Мыши Swiss Webster и 129S6 / SvEvTac были приобретены у Taconic Biosciences (Rensselaer, США). Все мыши были размещены в помещении для животных ETH Zurich. Все эксперименты на животных проводились под лицензией Zh252 / 17 в соответствии со стандартами и правилами Кантональной комиссии по этике Цюриха.

    Сбор ооцитов

    У самок мышей в возрасте четырех-пяти недель индуцировали суперовуляцию путем инъекции 5 МЕ гонадотропина сыворотки беременной кобылы с последующим введением 5 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ).Комплексы кумулюс-ооцит (КОК) собирали из яйцеводов через 15-17 часов после инъекции ХГЧ и помещали в среду М2. КОК обрабатывали 0,1% гиалуронидазой до диспергирования кумулюсных клеток.

    Получение и культивирование линий phaESC

    Получение линий phaESC от мышей 129S6 / SvEvTac проводили, как описано ранее [7]. Для введения делеций IG -DMR и h29 -DMR с использованием системы CRISPR-Cas9 ранее опубликованные олигонуклеотиды для направляющих РНК (гРНК) [16] лигировали в вектор pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 ( Addgene, # 42230), который был переварен рестриктазой BbsI (S1 фиг.).Последовательности гРНК перечислены в таблице S1. Одновременную трансфекцию 4 векторов Cas9 / gRNA, плазмиду piggyBac , несущую трансген CAG-EGFP-IRES-hygro, и гиперактивную плазмиду транспозазы piggyBac выполняли в линию phaESC с использованием липофектамина 2000, следуя протоколу производителя. Впоследствии отдельные гаплоидные клетки, экспрессирующие EGFP, выделяли проточным цитометром (MoFlo Astrios EQ, Beckman Coulter) после окрашивания 15 мкг / мл Hoechst 33342 (Invitrogen) и культивировали с облученными эмбриональными фибробластами мыши (MEF) в среде 2i плюс LIF [32, 33 ].После роста клональных одиночных колоний подмножество клеток в каждой линии анализировали проточным цитометром после окрашивания Hoechst для выбора клеточных линий, содержащих гаплоидные клетки, и генотипировали для скрининга клеточных линий с делециями IG -DMR и h29. -ДМР. Впоследствии популяция гаплоидных клеток 1n в каждой выбранной линии гаплоидных клеток очищалась путем сортировки клеток после окрашивания Hoechst и культивировалась на покрытых желатином планшете без MEF в среде 2i плюс LIF. Каждую гаплоидную клеточную линию поддерживали очисткой популяции гаплоидных клеток путем сортировки клеток после окрашивания Hoechst каждые 4-6 пассажей.Подсчет хромосом и второе генотипирование каждой клеточной линии проводили после того, как MEF были исключены пассажами клеток.

    Конструирование полуклонированных эмбрионов

    Конструирование полуклонированных эмбрионов было выполнено в соответствии с опубликованным протоколом [16] с некоторыми модификациями. DKO-phaESC поддерживали без MEF в среде 2i плюс LIF [32, 33]. Остановку M-фазы проводили для DKO-phaESC путем культивирования в среде с добавлением 0,05 мг / мл демеколцина (Merck) в течение 8 часов.После окрашивания Hoechst DKO-phaESC с содержанием ДНК 2n были отсортированы с помощью проточного цитометра. Отсортированные DKO-phaESC поддерживали в среде 2i плюс LIF с добавлением 20 мМ HEPES (Invitrogen), а пробирку, содержащую клеточную суспензию, держали на льду до использования для инъекции. Параллельно с этим собирали ооциты MII от суперовулированных самок B6D2F1. Для создания полуклонированных эмбрионов отсортированные одиночные DKO-phaESC инъецировали в ооциты MII с использованием микроманипулятора с пьезоуправлением (Eclipse Ti, Nikon; PiezoXpert, Eppendorf).После инъекции эмбрионы культивировали в среде KSOM в течение 1 часа и затем активировали в течение 6 часов в среде KSOM, содержащей 5 мМ хлорида стронция и 2 мМ EGTA. После активации эмбрионы промывали и культивировали в среде KSOM при 37 ° C и 5% CO 2 на воздухе.

    Вывод линий scESC

    После культивирования полуклонированных эмбрионов в среде KSOM в течение 4–5 дней каждую бластоцисту переносили на MEF в среде сыворотка плюс LIF, компонент которой был описан ранее [34].Из невылупившихся бластоцист zona pellucida удаляли обработкой раствором Тирода (Merck) перед переносом. После увеличения разрастания бластоцисты клетки поддерживали на MEF до пассажа 5. После пассажа 5 scESC поддерживали на покрытых желатином планшетах без MEF в сыворотке плюс среде LIF. Кариотипирование с помощью проточной цитометрии и подсчета хромосом проводили для scESCs на 9-м пассаже.

    Генотипирование

    Экстракцию ДНК

    из клеток и биопсии проводили с использованием буфера для лизиса (100 мМ Трис, pH 8.5, 200 мМ NaCl, 5 мМ EDTA и 0,2% SDS) с добавлением 0,1 мг / мл протеиназы K при 55 ° C в течение не менее 4 часов. Дебрис осаждали центрифугированием в течение 5 минут при 13000 об / мин. Супернатант заменяли в новую пробирку, содержащую равный объем изопропанола. После перемешивания пробирку центрифугировали в течение 5 минут при 13000 об / мин для осаждения осажденной геномной ДНК. Осадок промывали 70% этанолом и ресуспендировали в 50–200 мкл воды. ПЦР выполняли с использованием ДНК-полимеразы Phusion Hot Start II (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя.Продукты ПЦР разделяли электрофорезом на 1,5% агарозных гелях и окрашивали бромидом этидия для визуализации в УФ-трансиллюминаторе. Праймеры, используемые для генотипирования, перечислены в таблице S1.

    Анализ транскрипции

    РНК

    экстрагировали с помощью набора RNeasy Mini (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя, включая расщепление ДНК на колонке с использованием ДНКазы, не содержащей РНКаз (Qiagen). Концентрацию РНК определяли с помощью NanoDrop Lite (Thermo Fisher Scientific). Всего 500 нг РНК подвергали обратной транскрипции с использованием PrimeScript RT Master Mix (Takara) в соответствии с инструкциями производителя.ОТ-ПЦР выполняли в формате 384 лунок на приборе 480 Lightcycler (Roche) с использованием KAPA SYBR FAST qPCR KIT (Kapa Biosystems). Выражение изменения складки рассчитывали с использованием метода ΔΔct. Выражение Gapdh использовали для нормализации. Праймеры, используемые для анализа транскрипции, перечислены в таблице S1.

    Подсчет хромосом

    Для кариотипирования на предметных стеклах готовили хромосомные распределения ESC, как описано [35]. Хромосомы окрашивали раствором Гимза (Merck), промывали буфером Гурра, а затем хромосомы отображали под микроскопом (Axio Observer Z1, Zeiss).Снимки делали с помощью камеры ORCA-Flash5.0 (Hamamatsu Photonics K.K.) и определяли количество хромосом.

    In vitro оплодотворение (ЭКО)

    Масса сперматозоидов, собранных из хвостового придатка яичка самцов Swiss Webster, была предварительно инкубирована в Sequential Fert (ORIGIO) при 37 ° C в атмосфере 5% CO 2 на воздухе. КОК собирали из ампулы яйцевода суперовулированных самок Swiss Webster. После 1 часа предварительной инкубации массы сперматозоидов небольшую аликвоту суспензии сперматозоидов добавляли в каплю Sequential Fert, содержащую КОК.Через шесть часов ооциты промывали и переносили в среду KSOM. Развитие эмбриона до стадии 2 клеток оценивали через 24 часа после ЭКО.

    Перенос эмбриона

    Самок-реципиентов Swiss Webster спаривали с вазэктомированными самцами Swiss Webster накануне вечером, и наличие пробок было подтверждено утром в день переноса эмбрионов. Девять или десять двухклеточных эмбрионов, полученных с помощью инъекции DKO-phaESC, и 5 контрольных двухклеточных эмбрионов с помощью ЭКО были перенесены в яйцеводы самок-реципиентов псевдобеременных.На 19.5 день беременности доношенные детеныши родились естественным путем от самок-реципиентов.

    Бисульфитное секвенирование

    Геномную ДНК экстрагировали из пальцев ног новорожденных полуклонированных мышей и биопсию уха трехнедельных мышей B6D2F1 с буфером для лизиса, содержащим протеиназу К, с последующим осаждением изопропанолом. Конверсию бисульфита проводили с использованием набора EZ DNA Metylation Gold (ZYMO Research). ПЦР проводили при следующем температурном профиле: 30 секунд 98 ° C, 20 x (10 секунд 98 ° C, 30 секунд 65-55 ° C с -0.5 ° C за цикл, 30 секунд 72 ° C), 35 раз (10 секунд 98 ° C, 30 секунд 55 ° C, 30 секунд 72 ° C), 5 минут 72 ° C. Продукты ПЦР клонировали в вектор pJet1.2 с использованием набора CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Fisher Scientific) с последующей трансформацией в компетентный DH5α E . coli . Последовательности вставок для каждой колонии получали через коммерческую службу Ecoli NightSeq (Microsynth). Бисульфитное секвенирование анализировали с помощью инструмента анализа метилирования QUMA (http://quma.cdb.riken.jp/). Праймеры, используемые для ПЦР и секвенирования, перечислены в таблице S1.

    Статистический анализ

    Для сравнения количественных уровней экспрессии РНК импринтированных генов измерения были проанализированы с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8 с использованием двустороннего непарного t-критерия. Статистически значимым считалось значение p <0,05.

    Вспомогательная информация

    S1 Рис. Удаление

    IG -DMR и h29 -DMR в линиях phaESC.

    (A) Дизайн мРНК и праймеров, нацеленных на делеции IG -DMR.(B) Дизайн гРНК и праймеров, нацеленных на делеции h29 -DMR. (C) Фрагменты ПЦР, фланкирующие как IG, -DMR (319 п.н.) и h29 -DMR (407 п.н.) праймерами, нацеленными на удаленные локусы, наблюдались в 2 линиях DKO-phaESC, тогда как удаленные последовательности отсутствовали в DKO-phaESC. -1 и DKO-phaESC-2.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233072.s001

    (PDF)

    S2 Рис. Получение и генотипирование линий scESC.

    (A) Получение линий scESC из бластоцист, полученных путем инъекции DKO-phaESC в ооциты.Показаны изображения бластоцист, разрастания (пассаж 0) и scESCs после образования. Обычная черная полоса, 100 мкм; жирная черная полоса, 200 мкм; белая полоса, 100 мкм. (B) Генотипирование 3 линий scESC. Все 3 линии scESC проявляли аллели как дикого типа, так и мутантные для IG -DMR и h29 -DMR, что указывает на то, что геном как ооцитов, так и DKO-phaESCs вносит вклад в геном бластоцист.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233072.s002

    (PDF)

    S3 Рис. Генотипирование поколения F1, рожденного от полуклонированных мышей F0.

    Генотипирование на основе

    ПЦР было выполнено для 15 мышей F1, рожденных от полуклонированных самок (F0 № 6 и 7) и самцов Swiss Webster дикого типа. Трансген EGFP унаследован 7 из 15 мышей F1.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233072.s003

    (PDF)

    Благодарности

    Мы благодарим г-на Стефана Бутца и доктора Тункая Баубека за предоставленные праймеры и советы по бисульфитному секвенированию. Мы также благодарим г-жу Мишель Шаффнер и г-на Томаса М. Хеннека за их техническую поддержку по переносу эмбрионов.

    Список литературы

    1. 1. Сурани М.А., Бартон С.К., Норрис М.Л. Развитие восстановленных яиц мышей предполагает импринтинг генома во время гаметогенеза. Природа. 1984. 308 (5959): 548–50.
    2. 2. Кавахара М., Ву К., Такахаши Н., Морита С., Ямада К., Ито М. и др. Высокочастотная генерация жизнеспособных мышей из искусственно созданных би-материнских эмбрионов. Nat Biotechnol. 2007. 25 (9): 1045–50.
    3. 3. Коно Т., Обата Ю., Ву Ку, Нива К., Оно Ю., Ямамото Ю. и др.Рождение партеногенетических мышей, которые могут развиваться до взрослого возраста. Природа. 2004. 428 (6985): 860–4.
    4. 4. Лейтон PA, Ingram RS, Eggenschwiler J, Efstratiadis A, Tilghman SM. Нарушение импринтинга, вызванное делецией области гена h29 у мышей. Природа. 1995. 375 (6526): 34–9.
    5. 5. Лин С.П., Янгсон Н., Такада С., Зейтц Х., Рейк В., Полсен М. и др. Асимметричная регуляция импринтинга на материнских и отцовских хромосомах в импринтированном кластере Dlk1-Gtl2 на хромосоме 12 мыши.Нат Жене. 2003. 35 (1): 97–102.
    6. 6. Эллинг У., Таубеншмид Дж., Вирнсбергер Дж., О’Мэлли Р., Демерс С.П., Ванхэлен К. и др. Прямая и обратная генетика посредством получения гаплоидных эмбриональных стволовых клеток мыши. Стволовая клетка. 2011; 9 (6): 563–74.
    7. 7. Leeb M, Wutz A. Получение гаплоидных эмбриональных стволовых клеток из эмбрионов мыши. Природа. 2011. 479 (7371): 131–4.
    8. 8. Ли В., Шуай Л., Ван Х, Донг М., Ван М., Сан Л. и др. Андрогенетические гаплоидные эмбриональные стволовые клетки производят живых трансгенных мышей.Природа. 2012. 490 (7420): 407–11.
    9. 9. Ян Х, Ши Л., Ван Б. А., Лян Д., Чжун С., Лю В. и др. Создание генетически модифицированных мышей путем инъекции в ооциты андрогенных гаплоидных эмбриональных стволовых клеток. Клетка. 2012. 149 (3): 605–17.
    10. 10. Leeb M, Dietmann S, Paramor M, Niwa H, Smith A. Генетическое исследование выхода из самообновления с использованием гаплоидных эмбриональных стволовых клеток. Стволовая клетка. 2014; 14 (3): 385–93.
    11. 11. Монфорт А., Ди Минин Г., Постлмайр А., Фрейман Р., Ариети Ф, Тор С. и др.Идентификация Spen как решающего фактора функции Xist посредством прямого генетического скрининга в гаплоидных эмбриональных стволовых клетках. Cell Rep. 2015; 12 (4): 554–61.
    12. 12. Петтитт С.Дж., Рехман Флорида, Байрами И., Броу Р., Валлберг Ф., Козарева И. и др. Генетический скрининг с использованием транспозона PiggyBac в гаплоидных клетках идентифицирует Parp1 как медиатор токсичности олапариба. PLoS One. 2013; 8 (4): e61520.
    13. 13. Ли З, Ван Х, Фенг Дж, Ван Л, Хе З, Ван И и др. Рождение фертильного бимернального потомства после интрацитоплазматической инъекции партеногенетических гаплоидных эмбриональных стволовых клеток.Cell Res. 2016; 26 (1): 135–8.
    14. 14. Чжун Ц., Се З., Инь Ц., Дун Р., Ян С., Ву И и др. Партеногенетические гаплоидные эмбриональные стволовые клетки эффективно поддерживают образование мышей путем инъекции ооцитов. Cell Res. 2016; 26 (1): 131–4.
    15. 15. Ван Х, Хе З, Донг М., Гу Т, Ло З.З., Тэн Ф. и др. Партеногенетические гаплоидные эмбриональные стволовые клетки дают фертильных мышей. Cell Res. 2013. 23 (11): 1330–3.
    16. 16. Чжун Ц., Инь Ц., Се З, Бай М., Дун Р., Тан В. и др.CRISPR-Cas9-опосредованный генетический скрининг мышей с гаплоидными эмбриональными стволовыми клетками, несущими библиотеку направляющих РНК. Стволовая клетка. 2015; 17 (2): 221–32.
    17. 17. Li ZK, Wang LY, Wang LB, Feng GH, Yuan XW, Liu C и др. Получение бимернальных и бипатернальных мышей из гипометилированных гаплоидных ЭСК с делециями импринтирующей области. Стволовая клетка. 2018; 23 (5): 665–76 e4.
    18. 18. Ли Кью, Ли Й, Ян С., Хуанг С., Ян М., Дин И и др. CRISPR-Cas9-опосредованный скрининг редактирования оснований у мышей выявляет аминокислоты DND1, которые имеют решающее значение для развития первичных зародышевых клеток.Nat Cell Biol. 2018; 20 (11): 1315–25.
    19. 19. Цуйко О., Яценко Т., Парамесваран Грейс Л.К., Кург А., Вермиш Дж. Р., Ланнер Ф. и др. Спекулятивный взгляд на эмбриональную анеуплоидию: могут ли быть задействованы молекулярные пути? Dev Biol. 2019; 447 (1): 3–13.
    20. 20. Сторчова З., Пеллман Д. От полиплоидии к анеуплоидии, нестабильности генома и раку. Nat Rev Mol Cell Biol. 2004. 5 (1): 45–54.
    21. 21. Eglitis MA, Wiley LM. Тетраплоидия и раннее развитие: влияние на время развития и эмбриональный метаболизм.J Embryol Exp Morphol. 1981; 66: 91–108.
    22. 22. Кауфман М.Х., Уэбб С. Постимплантационное развитие тетраплоидных эмбрионов мыши, полученных с помощью электрослияния. Разработка. 1990. 110 (4): 1121–32.
    23. 23. Ямазаки В., Такахаши М., Кавахара М. Ограниченное развитие триплоидных плодов мышей с неорганизованной экспрессией импринтированных генов. Зигота. 2015; 23 (6): 874–84.
    24. 24. Имаи Х., Ивамори Т., Кусакабе К.Т., Кисо Й., Оно Э., Кано К. Гиперполиплоидные эмбрионы выживают после имплантации мышам.Зигота. 2020: 1–3.
    25. 25. Коно Т., Обата Ю., Йошимзу Т., Накахара Т., Кэрролл Дж. Эпигенетические модификации во время роста ооцитов коррелируют с расширенным партеногенетическим развитием у мышей. Нат Жене. 1996. 13 (1): 91–4.
    26. 26. Плашаерт Р.Н., Бартоломей М.С. Геномный импринтинг в развитии, росте, поведении и стволовых клетках. Разработка. 2014. 141 (9): 1805–13.
    27. 27. Джордан М.А., Уилсон Л. Микротрубочки как мишень для противоопухолевых препаратов.Нат Рев Рак. 2004. 4 (4): 253–65.
    28. 28. Потапова Т, Горбский ГЖ. Последствия ошибок сегрегации хромосом при митозах и мейозах. Биология (Базель). 2017; 6 (1).
    29. 29. Амано Т., Като Ю., Цунода Ю. Сравнение термически обработанных и тетраплоидных бластоцист для производства мышей, полностью полученных из ES-клеток. Зигота. 2001. 9 (2): 153–7.
    30. 30. Эгган К., Акуцу Х., Лоринг Дж., Джексон-Грусби Л., Клемм М., Rideout WM 3rd и др. Гибридная сила, разрастание плода и жизнеспособность мышей получены путем ядерного клонирования и комплементации тетраплоидных эмбрионов.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2001; 98 (11): 6209–14.
    31. 31. Надь А., Гоча Э., Диаз Э.М., Придо В.Р., Ивани Э., Марккула М. и др. Одни только эмбриональные стволовые клетки способны поддерживать развитие плода у мышей. Разработка. 1990. 110 (3): 815–21.
    32. 32. Николс Дж., Джонс К., Филлипс Дж. М., Newland SA, Руд М., Мэнсфилд В. и др. Подтвержденные компетентные к зародышевой линии линии эмбриональных стволовых клеток от мышей, не страдающих ожирением, диабетом. Nat Med. 2009. 15 (7): 814–8.
    33. 33. Ying QL, Wray J, Nichols J, Batlle-Morera L, Doble B, Woodgett J, et al.Основное состояние самообновления эмбриональных стволовых клеток. Природа. 2008. 453 (7194): 519–23.
    34. 34. Postlmayr A, Dumeau CE, Wutz A. Cdk8 необходим для установления h4K27me3 и репрессии гена с помощью Xist и развития мыши. Разработка. 2020; 147 (11).
    35. 35. Campos PB, Sartore RC, Abdalla SN, Rehen SK. Препарат хромосомного распространения стволовых клеток человеческого эмбриона для кариотипирования. J Vis Exp. 2009 (31).

    Индукция функциональных тромбоцитов из фибробластов мыши и человека с помощью p45NF-E2 / Maf | Кровь

    Ранее мы сообщали, что МК и тромбоциты были получены из линии клеток преадипоцитов 3T3-L1, но не из исходной линии клеток фибробластов 3T3. 17 Экспрессия генов кандидатов в факторы транскрипции, которые, как сообщается, регулируют дифференцировку МК и продукцию тромбоцитов 8,9 , теперь сравнивали между клетками 3T3 и клетками 3T3-L1 (Таблица 1). Также были исследованы факторы, определяющие маркеры адипоцитов, CEBPα и рецептор, активируемый пролифератором пероксисом (PPAR) –γ. 34,41 Экспрессию гена оценивали по значениям порогового цикла; таким образом, более низкие значения указывают на более высокие уровни экспрессии. Экспрессия p45NF-E2 и CEBPα не определялась в клетках 3T3, но обнаруживалась в клетках 3T3-L1 с помощью qRT-PCR.Обе клеточные линии экспрессировали GATA2, FOG1, Fli1, RUNX1 и PPAR-γ, и уровни GATA1 не определялись (таблица 1). Основываясь на этих результатах, мы создали отдельные ретровирусы для экспрессии мышиного p45NF-E2 и его связывающих белков, Maf G и Maf K, 25-32 и CEBPα. Клетки 3T3, трансфицированные различными комбинациями этих генов, дифференцировались в МК. Дифференцировку МК оценивали по экспрессии CD41. Репрезентативные данные показаны на рисунке 1A. Клетки 3T3, трансфицированные комбинацией p45NF-E2, Maf G и Maf K , имели частоту CD41-положительных клеток 27 ± 8% по сравнению с клетками, трансфицированными либо CEBP α, либо p45NF-E2 один ( P =.003 и .19 соответственно), и клетки, трансфицированные p45NF-E2 плюс CEBP α ( P = 0,028), тогда как клетки 3T3, трансфицированные вектором без вставки кДНК, не реагировали с антителом против CD41 мыши. (Рисунок 1B). Клетки 3T3, трансфицированные комбинацией p45NF-E2, Maf G и Maf K , имели самую высокую частоту CD41-положительных клеток. В парном тесте Стьюдента t мы наблюдали, что эта тройная комбинация приводит к значительно более высокому проценту CD41-положительных клеток, чем трансфекция только p45NF-E2 ( P =.02). Дополнительная трансфекция CEBP α вместе с 3 факторами значительно увеличила количество CD41-положительных клеток ( P = 0,33). Приблизительно 70% клеток, экспрессирующих p45NF-E2–, Maf G– и Maf K, были также положительными по другому MK-специфическому маркеру, CD42b (рис. 1C). Экспрессия CD42b на клетках 3T3, трансфицированных вектором без вставки кДНК, не наблюдалась через 8 дней после культивирования (рис. 1С). Частота CD41- и CD42b-двойных положительных клеток составила 27.7 ± 2,1% (дополнительный рисунок 1, доступный на веб-сайте Blood ; см. Ссылку «Дополнительные материалы» в верхней части онлайн-статьи). Плоидность ДНК этих p45NF-E2–, Maf G– и Maf K-экспрессирующих клеток варьировала от 2N до 16N (Рисунок 1D), плоидность ДНК клеток 3T3 в день 0 была преимущественно 2N с небольшим количеством 4N (Рисунок 1D). Эти находки подтверждают, что одновременная экспрессия p45NF-E2, Maf G и Maf K достаточна для индукции полиплоидных МК из фибробластов 3T3.

    универсальный триггер дизъюнкции сестринских хроматид, но не прогрессии цикла хромосом

    Тип журнала: Артикул119599 Университетская страница1195 : Выпуск
    Название: Separase: универсальный триггер дизъюнкции сестринских хроматид, но не прогрессирования цикла хромосом
    Авторы: Wirth, KzG
    Wirt
    Kudo, NR
    Desdouets, C
    Zetterberg, A
    Taghybeeglu, S
    Seznec, J
    Ducos, GM
    Ricci, R
    Firnberg, N
    Peters, JM
    Nasmyth, K
    Резюме: Сепараза представляет собой протеазу, освобождение которой от ингибирующего шаперона Секурина запускает дизъюнкцию сестринских хроматид в начале анафазы у дрожжей путем расщепления клейзиновой субъединицы когезина.Мы создали условные нокаутные аллели генов Separase и Securin мыши. Удаление обеих копий Separase, но не Securin, приводит к гибели эмбрионов. Потеря секурина снижает активность Separase, поскольку удаление только одной копии гена Separase является летальным для эмбрионов, лишенных Securin. В эмбриональных фибробластах истощение сепарации блокирует разделение сестринских хроматид, но не предотвращает другие аспекты митоза, цитокинеза или репликации хромосом. Таким образом, фибробласты, лишенные Separase, становятся сильно полиплоидными.Гепатоциты, стимулированные к пролиферации in vivo посредством гепатэктомии, также становятся необычно большими и полиплоидными в отсутствие Separase, но способны регенерировать функциональную печень. Раздельное истощение костного мозга вызывает аплазию и предполагаемую гибель кроветворных клеток, кроме эритроцитов. Разрушение сцепления сестринских хроматид с помощью Separase может быть универсальным признаком митоза в эукариотических клетках.
    Дата выдачи: 13 марта 2006 г.
    Дата принятия: 14 февраля 2006 г.
    URI: http: // hdl.handle.net/10044/1/84204
    DOI: 10.1083 / jcb.200506119
    ISSN: 0021-9525
    Издатель: Рокфеллер
    847
    Конечная страница: 860
    Название журнала / книги: Журнал клеточной биологии
    Том: 172
    Заявление об авторских правах: © The Rockefeller University Press
    Ключевые слова: Наука и технологии
    Науки о жизни и биомедицина
    Клеточная биология
    ДРОЖЖИ ДЕЛЕНИЯ
    САХАРОМИЦЫ-ЦЕРЕВИЗИА10710 СОВМЕСТНИК
    СОДЕРЖАНИЕ ДРОЖЕК-ЦЕРЕВИЗИА10
    АНАПЕРАЗА 907
    МЕТАФАЗА
    РАЗРЫВ
    СЕКУРИН
    Анафаза
    Животные
    Протеин-носитель ns
    Клеточный цикл
    Белки клеточного цикла
    Клеточная линия
    Хромосомные белки, не гистоновые
    Хромосомная сегрегация
    Время репликации ДНК
    Эмбриональное развитие
    Эндопептидазы
    Женские
    Фибробласты
    Гены, летальные клетки
    Гепатоциты
    Гепатоциты
    Гепатоциты
    Гепатоциты
    Мыши.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.