• Он не вирусный, нетоксичный и может использоваться на всех типах клеток, включая млекопитающих, бактерии, водоросли, растения и дрожжи.
• Его можно использовать на клетках во всех формах, in vitro или in vivo / ex vivo.
• In vitro в переводе с латыни означает «внутри стекла» и включает суспензионную клетку, срез ткани / весь орган и прикрепленную клетку.
• In vivo / ex vivo. Латинское слово означает «внутри живого» и включает ткань / весь орган, in ovo и in utero.
• Он не ограничен размером плазмиды, захват происходит мгновенно и не требует инкубации.
• Это воспроизводимый, высокоэффективный и простой в использовании.

Приложения для электропорации

• Для доставки генов / лекарств, чтобы изучить влияние генов или лекарств на клетки.
• Для исследований, медицины, сельского хозяйства и производства.
• Разработка вакцины
• Для стимулирования более стойкого иммунного ответа.
• Клонирование В-клеток , для продукции моноклональных антител в клетках млекопитающих
• Библиотеки бактерий

Что можно использовать для электропорации?

• Бактерии
• Грибы / дрожжи
• Растения
• Прочие, насекомые, рыба, плесень и земноводные
• Млекопитающее
• Первичная культура эксплантата
• Установленные линии клеток
• Человек, in vitro, in vivo и ex vivo

Типичные трансфектанты

• ДНК / РНК
• Антитела / Белки
• Наркотики
• Другие молекулы / ионы

Электропорация и конкурирующие методы трансфекции

Анджело ДеПальма Ph.D. Писатель GEN

Благодаря своей универсальности — она ​​работает с любой клеткой, любым организмом — электропорация является уникальным преимуществом.

Электропорация использует электрический импульс для введения в клетки новых видов, обычно полярных молекул. Этот метод использует слабые взаимодействия между фосфолипидными бислоями, которые поддерживают целостность клеточных мембран. В типичной клеточной мембране фосфолипиды расположены так, что их полярные головные группы направлены наружу, а их гидрофобные хвостовые группы направлены внутрь, расположение, которое препятствует прохождению полярных молекул.Без какой-либо помощи полярные молекулы не могут войти.

Когда клетки испытывают управляемый электрический импульс, слой фосфолипидов открывается, создавая временные физические каналы, которые позволяют молекулам проникать. При правильных условиях каналы быстро закрываются, возвращая клетку в исходное состояние — за исключением того, что теперь клетка содержит инородные молекулы.

Помимо прямого введения генов, электропорация облегчает прямой перенос плазмид между клетками или видами, например, от бактерий к дрожжам.

Продолжаются обширные эксперименты по использованию электропорации для доставки лекарств и вакцин непосредственно в клетки живых организмов. Эта статья посвящена немедицинским приложениям.

Электропорация чаще всего используется для временной трансфекции клеток, хотя возможна и стабильная трансфекция. В биофармацевтической промышленности временная трансфекция позволяет производить до нескольких граммов белка для характеристики и доклинических исследований.В этом приложении электропорация с использованием плазмид оказалась надежной и предсказуемой. Электропорация аналогичным образом дает стабильно трансфицированные клетки при условии, что ДНК вводится в линеаризованной форме путем ее предварительной обработки рестрикционным ферментом.

Одна техника среди многих

Электропорация прочно вошла в арсенал методов трансфекции, которые включают вирусные векторы, химические методы или методы на основе реагентов, а также механическую доставку генов.Вирусные векторы являются наиболее распространенным методом получения стабильно трансфицированных клеток для производства терапевтических белков. Вирусные векторы обеспечивают очень высокую эффективность трансфекции, но ограничены по длине встроенной ДНК. Вирусные векторы также сталкиваются с проблемами, связанными с биобезопасностью и мутагенезом.

Другие механические методы, такие как микропреципитация, микроинъекция, липосомы, бомбардировка частицами, сонопорация, лазерно-индуцированная порация и трансфекция шариками, все используются экспериментально.У этих механических приемов есть общая нить. Они разрушают клеточные мембраны и тем самым позволяют ДНК проникать в клетку. Некоторые подходы — например, «генная пушка» — включают проекцию генов непосредственно через мембрану в цитоплазму. Отсюда гены могут мигрировать в ядро.

Кроме того, существуют гибридные методы, в которых используются возможности механических и химических методов трансфекции. Например, за последнее десятилетие появилось множество статей о магнитофекции, методологии трансфекции, сочетающей химическую трансфекцию с механическими методами.Например, катионные липиды можно использовать в сочетании с генными пушками или электропораторами. Большая часть литературы по магнитофекции связана с доставкой генов и терапевтических молекул живым организмам.

Электропорация имеет несколько преимуществ: универсальность (работает с любым типом клеток), эффективность, очень низкие требования к ДНК и способность работать с живыми организмами. К недостаткам можно отнести потенциальное повреждение клеток и неспецифический транспорт молекул внутрь и из клетки.

Но среди подходов к химической, механической и вирусной трансфекции только электропорация обеспечивает разумную уверенность в успехе независимо от клетки или организма-мишени.

Например, химическая трансформация и электропорация — два основных метода введения ДНК в Escherichia coli . В последнем случае бактерии необходимо сначала сделать «компетентными» путем удаления буферных солей, чтобы ток достигал клеток, а затем применить электрический импульс при 0 ° C, чтобы уменьшить повреждение микроорганизмов.Химическая трансформация включает суспензию в CaCl ₂ , которая создает поры, после чего следует тепловой шок, который перемещает ДНК в клетки.

Другой подход использует катионные липиды для вскрытия клеточных мембран. Электропорация менее обременительна и более эффективна, работает с более разнообразными типами клеток и легче поддается стандартным методам, чем химическая трансфекция. Однако некоторые исследователи предпочитают химическое преобразование, поскольку оно не требует покупки инструмента.

Обеспечение инноваций

Хотя электропорация была впервые описана в 1965 году, она продолжает открывать пути к инновационной науке с точки зрения инструментов, протоколов и экспериментов. По крайней мере, дюжина университетских групп разработала устройства электропорации на основе микроэлектромеханических систем (MEMS). Одно из преимуществ микроканалированных устройств заключается в том, что они могут быть спроектированы так, чтобы прикладывать не большее напряжение, чем достаточное для достижения разумного включения макромолекул.Это преимущество также является недостатком. В отличие от коммерческих систем электропорации, чипы работают не со всеми клетками.

Группа на факультете биомедицинской инженерии Технологического университета Луизианы под руководством доктора философии Шэнняна Ванга обнаружила, что наночастицы золота повышают эффективность коммерческого оборудования для электропорации. ¹ Ван считает, что частицы, обладающие высокой проводимостью, снижают проводимость клеточной среды, действуя как «виртуальные микроэлектроды», помогая открывать фосфолипидные мембраны.Он утверждает, что улучшенная производительность (повышенная эффективность доставки ДНК) и более высокая жизнеспособность клеток за счет более низких напряжений поции.

Исследователи из Charité Universitätsmedizin Berlin ² разработали комбинированную стратегию электропорации с прямоугольными импульсами для воспроизводимой трансфекции клеток. Бритта Зигмунд, доктор медицины, и ее коллеги помещают клетки в буфер и подвергают их воздействию начального импульса высокого напряжения, за которым следует импульс низкого напряжения с разной электрической и временной величиной.Доктор Зигмунд утверждает, что жизнеспособность сравнима со стандартной электропорацией и что эффективность трансфекции достигает 95%. Она заключает, что метод может быть «легко адаптирован для клеток, которые считаются трудными для трансфекции».

Помимо обычного переноса ДНК, трансфекция использовалась для введения мешающей РНК в различные типы клеток. Этот метод позволяет проводить контролируемые мелкомасштабные исследования эффективности дозирования и доставки. Проблемы с дозированием и доставкой мешали практическому применению РНК-интерференции в терапии.Но, по крайней мере, в одном исследовании ставится под вопрос, наиболее эффективно ли внедряются гены РНК-интерференции в первичные клетки посредством реагентов для трансфекции или электропорации. ³

Кирсти Дженсен, доктор философии, и ее коллеги из Эдинбургского университета сравнили эффективность 11 наборов реагентов для временной трансфекции и электропорации для подавления иммуномодулирующего гена средиземноморской лихорадки (MEFV) в макрофагах, полученных из моноцитов крупного рогатого скота. Группа проверила методологии поглощения малых мешающих РНК, нокдауна целевого гена, клеточной токсичности и индукции интерферонового ответа типа I.

Электропорация была примерно такой же эффективной для подавления MEFV, как и реагенты для трансфекции. В отличие от реагентов электропорация не вызывала интерферонового ответа, но жизнеспособность клеток была ниже. Вопросы жизнеспособности и эффективности трансфекции для электропорации обычно принимают за чистую монету.

Доктор Дженсен пришел к выводу, что «использование реагентов для трансфекции более подходит, чем электропорация для нашей работы по изучению роли генов макрофагов хозяина в ответе на инфекцию», но что «выбор трансфекции или электропорации малых интерферирующих РНК в клетки зависит от индивидуальные эксперименты.”

По крайней мере, в некоторых случаях, когда результаты электропорации были неоптимальными, исследователи пренебрегли оптимизацией условий, отличных от силы электрического импульса. Как недавно было отмечено Ху и соавторами, ⁴ эффективность электропорации зависит от неэлектрических факторов, таких как тип клетки или ткани и состав ДНК.

Электропорация стала незаменимым методом для биологии развития как in vitro, так и in vivo. Большая часть этой работы происходит в отдельных клетках, что способствует созданию модели, представляющей большой интерес в терапии, диагностике, доставке лекарств и клеточной биологии.Прямая нанопорация единичных клеток затруднена из-за неопределенности, присущей жизнеспособности постпорации.

Исследователи из Северо-Западного университета разработали одноклеточный метод, который обеспечивает высокую жизнеспособность и эффективность. ⁵ В их подходе используется микрокантилеверное устройство, нанофонтанный зонд (NFP). Он доставляет молекулы к клеткам более мягко, чем объемная микроинъекция или нанопорация. Исследователи продемонстрировали опосредованную NFP электропорацию отдельных клеток HeLa с эффективностью трансфекции выше 95%, жизнеспособностью 92% и качественным контролем дозировки.

NFP представляют собой усовершенствование по сравнению со старыми технологиями трансфекции, в которых используются зонды атомно-силового микроскопа. Методы, основанные на атомно-силовой микроскопии, часто приводят к тому, что клетки теряют прикрепление или разрываются. NFP наносит меньше повреждений клеткам.

Ресурсы:
¹ Zu Y, Huang, S, Liao, W-C, Lu Y, Wang S.Наночастицы золота усиливают электропорацию для трансфекции клеток млекопитающих. J. Biomed. Nanotechnol. Июнь 2014 г .; 10 (6): 982–92.
² Stroh T., Erben U, Kühl AA, Zeitz M, Siegmund B. Комбинированная импульсная электропорация — новая стратегия высокоэффективной трансфекции клеток человека и мыши. PLoS ONE 2010; 5 (3): e9488.
³ Дженсен К., Андерсон Дж. А., Гласс Э. Дж. Сравнение доставки малой интерферирующей РНК (миРНК) в макрофаги, полученные из моноцитов крупного рогатого скота, путем трансфекции и электропорации.Вет. Иммунол. Immunopathol. 15 апреля 2014 г .; 158 (3–4): 224–32.
⁴ Ху Дж., Кутрера Дж., Ли С. Влияние неэлектрических факторов на перенос электрических генов. Методы Мол. Биол. 2014; 1121: 47–54.
⁵ Канг В., Явари Ф., Минари-Джоландан М. и др. Электропорация с нанофонтанным зондом (NFP-E) одиночных клеток. Nano Lett. 2013; 13 (6): 2448–57.

Определение электропорации по Merriam-Webster

Бактериальная трансформация: электропорация | Протокол

Бактериальная трансформация — это естественный процесс, при котором бактерии поглощают чужеродную ДНК, а затем амплифицируют или клонируют ее.В лаборатории этот процесс можно вызвать искусственно, используя импульсы электрического поля высокого напряжения для создания пор в мембране бактериальной клетки, через которые может проходить плазмидная ДНК. Электропорация относится к этому методу, и в следующем видео будут продемонстрированы его принципы, пошаговая процедура и применение.

Прежде чем говорить об электропорации бактерий, важно понять, какой тип ДНК использовался в этих экспериментах: плазмида. Плазмида — это небольшой кольцевой внехромосомный фрагмент ДНК, который действует как вектор, носитель вашей конкретной последовательности ДНК.

Независимо от того, является ли эта последовательность геном флуоресцентного белка медузы или ферментом растений, она вставляется в плазмиду через область, называемую сайтом множественного клонирования или MCS. Эта область содержит специфические последовательности, которые расщепляются эндонуклеазами рестрикции или рестрикционными ферментами. Те же рестрикционные ферменты можно использовать для вырезания интересующей последовательности так, чтобы концы были комплементарны только что отрезанным концам плазмиды.

Плазмиды также содержат точку начала репликации, сокращенно ORI, которая указывает точку, в которой она будет реплицироваться.Когда дело доходит до трансформации, жизненно важное значение имеет ген устойчивости к антибиотикам. Как следует из названия, этот ген позволяет бактериям вырабатывать фермент, который нейтрализует антибиотик, позволяя им выживать в среде, содержащей антибиотик.

Для электропорации используется специальное устройство, называемое электропоратором. Обычно клетки помещают в кювету для электропорации, которая имеет электроды с каждой стороны, которые создают электрический контакт с устройством после его установки.

Бактериальные клетки, смешанные с ДНК, загружают в кювету для электропорации, и в течение нескольких миллисекунд прикладывают электрическое поле порядка от 1000 до 10 000 вольт на сантиметр.Это приводит к тому, что напряжение на мембране достигает 0,5-1 вольт, что, как полагают, приводит к перестройке фосфолипидного бислоя, который составляет клеточную мембрану, так что образуются поры. В этом состоянии плазмидная ДНК будет проходить через мембрану, и по завершении пульсации бислой восстановится.

Поглотив плазмиду, бактерии могут расти на чашках с агаром, содержащим антибиотик.

Теперь, когда мы узнали о плазмидах и механизме электропорации.Давайте посмотрим, как проводится процедура.

Клетки, которые могут легко впитывать ДНК, называются компетентными клетками. Наиболее распространенным типом компетентных бактерий, трансформируемых в исследованиях молекулярной биологии, является кишечная палочка, прокариотические бактерии, обитающие в нижнем отделе кишечника. E. coli, подготовленные для электропорации, называются электрокомпетентными клетками.

При работе с бактериями убедитесь, что рабочая зона максимально чистая.

Работа с бактериями также требует соблюдения асептических правил. Обычно это включает использование горелки Бунзена для стерилизации инструментов и создания конвекционного тока, который удерживает переносимые по воздуху загрязнители в рабочем пространстве.

Непосредственно перед электропорацией предварительно нагрейте среду до комнатной температуры, доведите чашки с агаром, содержащим антибиотик, до 37 ° C и охладите кюветы для электропорации на льду.

Далее разморозить промытые электрокомпетентные клетки на льду.

Добавьте 1-5 мкл холодной плазмиды 1 нг / мкл, не содержащей соли, к бактериальным клеткам, осторожно перемешайте и добавьте смесь в холодную кювету.Убедитесь, что нет пузырей.

Установите напряжение и напряженность поля электропоратора на правильные настройки для ваших клеток. Здесь вы видите, что электропоратор настроен на 1700 вольт и дает напряженность поля 17 кВ / см.

Вытрите кювету насухо снаружи и поместите ее в электропоратор. Пульсируйте клетки, пока не услышите звуковой сигнал.

Неудачная пульсация вызывает электрический разряд, который проявляется в виде видимой искры и слышимого хлопка. Этот разряд, называемый дугой, может быть результатом слишком большого количества соли в ваших компетентных клетках или ДНК.

Успех вашего преобразования можно предсказать, указав постоянную времени, то есть время, необходимое для спада напряжения после подачи импульса. Когда присутствует соль и раствор для электропорации очень проводящий, распад происходит быстро, вызывая разряд и тем самым убивая многие из ваших клеток. Для бактерий подходящая постоянная времени составляет 5-10 миллисекунд.

Сразу после пульсации снимите кювету и добавьте 1 мл среды непосредственно в клетки.Эту среду, содержащую клетки, помещают в пробирку и инкубируют при 37 ° C в течение 1 часа при встряхивании для восстановления клеток.

Затем, используя асептические методы, добавьте 20-200 мкл клетки в чашку с агаром, содержащую антибиотик. Переверните чашки так, чтобы агар был сверху и конденсат не попадал в клетки, и инкубируйте в течение ночи при 37 ° C.

Бактерии, трансформированные плазмидой, должны образовывать колонии. Подсчитайте колонии и рассчитайте эффективность трансформации, которая представляет собой количество успешных трансформантов, деленное на общее количество посевной ДНК.

Агар и среда, которые обеспечивают питание для ваших бактерий, должны быть предварительно подготовлены и стерилизованы в автоклаве. Перед использованием дайте жидкой среде остыть до комнатной температуры и дайте агару остыть до 50-55 ° C — температуры, при которой можно добавлять антибиотик и разливать чашки. Затем дайте пластинам остыть до комнатной температуры, чтобы они застыли.

Поскольку бактерии, используемые для трансформации, хранятся в морозильной камере, их необходимо сначала разморозить на льду, разложить на чашке с агаром без антибиотиков, а затем вырастить в течение ночи при 37 ° C.

Используя асептическую технику, выберите бактериальную колонию из чашки с агаром и вырастите ее в более крупной культуре объемом 500 мл в течение ночи при 37 ° C во встряхиваемом инкубаторе.

Пока клетки растут, приготовьте около литра деионизированной воды и сделайте 10% -ный раствор глицерина и воды по объему. Автоклавируйте растворы и дайте им остыть при 4C.

Измерения абсорбции используются для определения того, находятся ли бактерии в средней логарифмической фазе роста, что означает, что они легко поглощают ДНК.Как только клетки достигли этой фазы, поместите их на лед и держите там на протяжении всей процедуры.

Затем промойте клетки, разделив их в двух больших центрифужных пробирках и вращая при 4 ° C, слейте супернатант и ресуспендируйте в 100 мл холодной стерильной деионизированной воды. Повторите этот шаг хотя бы еще раз. Целью данного этапа является удаление соли, которая сильно повлияет на технику электропорации.

Выполните две дополнительных промывки в 50 мл 10% глицерина в воде и, наконец, ресуспендируйте бактерии в этом же растворе.

Добавьте 50 мкл клеток в несколько пробирок Эппендорфа. Эти клетки теперь готовы к использованию в электропорации и должны храниться при 4˚C. Или их можно мгновенно заморозить и хранить при -80˚C.

Как вы скоро увидите, электропорация имеет множество применений.

Альтернативой электропорации является трансформация тепловым шоком, которая основана на воздействии на бактерии хлорида кальция и тепла с целью введения ДНК в ваши клетки.

В целом тепловой шок более мягко воздействует на бактерии, чем электропорация, и не требует низкого содержания соли.Реакции лигирования, которые включают в себя вставку целевого гена в плазмиду, можно использовать непосредственно в трансформации теплового шока. Трансформация тепловым шоком дешевле электропорации и не требует дорогостоящего оборудования или кювет. С другой стороны, тепловой шок приводит к более низкой эффективности трансформации, чем электропорация, и занимает больше времени. Также она ограничена протопластами бактерий, дрожжей и растений, тогда как электропорация может применяться к клеткам млекопитающих.

Здесь вы видите эмбриональные фибробласты мыши, загружаемые в кювету для электропорации.После завершения электропорации можно определить эффективность трансформации, наблюдая, в какой степени клетки продуцируют белок зеленой флуоресценции, кодируемый плазмидой. Трансфекция — это термин, обозначающий трансформацию клеток млекопитающих, которая обычно требует более низкой напряженности поля, чем бактериальные клетки, и более высоких постоянных времени.

Электропорацию также можно проводить на целых животных, таких как развивающийся куриный эмбрион, который вы здесь видите. Плазмидную ДНК вводят в мозг цыпленка, а затем используют зонд электропорации для приложения электрического поля к ткани мозга.Через день или два нейроны вырабатывают зеленые и красные флуоресцентные белки, кодируемые плазмидой, и ученые могут наблюдать структурные изменения в развивающемся мозге цыпленка.

Вы только что смотрели введение JoVE в бактериальную трансформацию с помощью электропорации. В этом видео представлена ​​плазмида как наиболее часто трансформируемый тип ДНК, обсуждается биофизический механизм, лежащий в основе электропорации, показана обобщенная процедура проведения электропорации и описывается, как электропорация может использоваться в системе млекопитающих.Спасибо за просмотр!

Электропорация |

Обзор

Электропорация — это метод, который использует полупроницаемую природу клеточных мембран, преимущество присутствия фосфолипидного бислоя. Когда суспензия клеток, смешанная с чужеродным генетическим материалом, подвергается воздействию оптимальных диапазонов электрической активности, области в фосфолипидном бислое демонстрируют кратковременные нарушения, называемые порами. Именно через эти временные поры (отверстия) экзогенная ДНК, РНК или белки могут проникать в клетку.

Процесс электропорации состоит из разряда напряжения, передаваемого через жидкость клетки в импульсе длительностью несколько микросекунд. Электрический импульс разрушает фосфолипидный бислой мембраны и вызывает образование водных пор в клеточной мембране. Электрический потенциал на мембране клетки повышается примерно на 0,5–1,0 В, так что заряженные молекулы (например, РНК или ДНК) перемещаются через мембрану и через поры.

Электропорация — это широко используемый метод трансфекции и трансформации в клеточной и молекулярной биологии.Ученые используют специальное оборудование, такое как электропораторы, кюветы и пипектроды (например, пистолет для клонирования), для проведения экспериментов по электропорации. Электропораторы бывают разных форм и размеров, от настольных машин до портативных устройств.

Последствия электропорации

Электропорированные клетки после обработки становятся чрезвычайно хрупкими. Как только поры сформированы, ученые не могут контролировать, что входит в клетку и выходит из нее. В результате некоторые элементы могут умереть или выйти из строя из-за этого нежелательного обмена материала.Небольшие отклонения от оптимизированных условий силы электрического напряжения могут помешать клеткам вернуться в нормальное состояние. Вместо этого они могут показать постоянные разрывы в клеточной мембране и привести к гибели или токсичности клеток.

После подачи электрического напряжения, если оставить установку нетронутой, фосфолипидный бислой может перестроиться. За это время временные поры могут уплотняться (обратимая электропорация) или увеличиваться, тем самым разрывая клеточную мембрану (необратимая электропорация).Реагенты, называемые буферами электропорации, которые представляют собой составы, имитирующие состав клеточной цитоплазмы и улучшающие закрытие пор электропорации, позволяют заживать электропорированным клеточным мембранам и увеличивать жизнеспособность клеток.

Приложения

Встраивание экзогенной ДНК в клетки имеет решающее значение как для экспрессии новых генов, так и для подавления молчания существующих генов с помощью РНК-интерференции или молчания генов. Электропорация может быть в десять раз эффективнее химических реагентов, не требует специальных химических реагентов и может использоваться in vivo .Электропорация чрезвычайно полезна для линий клеток, которые трудно трансфектировать, и для первичной трансфекции клеток. Электропорация, широко используемая в генной терапии, лечении рака, слиянии клеток, переносе плазмид непосредственно из одной клетки в другую и создании систем нокаута генов (РНКи), является невероятно ценным методом. Существует даже несколько коммерчески доступных наборов для электропорации, которые могут помочь достичь высокой эффективности трансфекции и снизить цитотоксичность без обширной оптимизации экспериментальных параметров.

Ученые, проводящие эксперименты с Sus scrufa , обнаружили, что использование высокого напряжения во время электропорации точно убивает клетки-мишени, не оказывая никакого воздействия на окружающие ткани. Дальнейшие разработки указывают на лечение заболеваний, требующих точного иссечения тканей. При использовании для лечения рака его называют электрохимиотерапией рака опухоли. Некоторые компании заявляют о разработке эффективных устройств электропорации для удаления опухолей. Еще одно важное применение электропорации — это доставка ДНК-вакцин.ДНК-вакцины, хотя и все еще находятся в экспериментальной фазе, считаются более прямым и эффективным методом, чем обычная терапия рака.

Влияние состава буфера для электропорации на жизнеспособность клеток и эффективность электротрансфекции

Целью данного исследования было выявить влияние различных буферных растворов и импульсных характеристик на результаты электропорации. Таблицы 2 и 3 отображают результаты жизнеспособности и eTE, собранные в импульсных приложениях с постоянной приложенной энергией и постоянным общим потоком заряда, соответственно, для всех буферов электропорации, испытанных в исследовании.

Жизнеспособность клеток и эффективность электротрансфекции: постоянная прикладываемая электрическая энергия

Влияние состава буфера и потока заряда на жизнеспособность клеток и eTE оценивали в условиях, когда прикладываемая энергия оставалась постоянной (таблица 2). Отдельные двухфакторные дисперсионные анализы были выполнены для двух различных значений проводимости. Графики жизнеспособности для обеих проводимостей представлены на дополнительном рисунке 1. Для буферов 500 мкСм / см на жизнеспособность клеток существенно не влияли состав буфера, поток заряда или взаимодействие между ними.Для буферов с проводимостью 2000 мкСм / см влияние потока заряда на жизнеспособность является значительным ( p = 0,0044), тогда как состав буфера и взаимодействие между двумя переменными не имеют значительного влияния. Вместе эти результаты в целом подтверждают наши предыдущие наблюдения, что жизнеспособность клеток после электропорации в значительной степени зависит от общей электрической энергии, применяемой во время процедур трансфекции ²⁰ .

При анализе эффектов, которые состав буфера, поток заряда и взаимодействие этих переменных оказывают на eTE, обнаруживается аналогичная тенденция (значения eTE см. В таблице 2).Двусторонний дисперсионный анализ результатов с буферами проводимости 500 мкСм / см и 2000 мкСм / см показал, что как состав буфера ( p <0,0001), так и поток заряда ( p = 0,0073 / p <0,0001) оказывают существенное влияние на eTE, и что взаимодействие этих переменных не имеет значения. Однако значительный эффект состава буфера на eTE является результатом различного молекулярного содержания (т.е. Mg ²⁺ по сравнению с буферами на основе K ⁺ ) буфера для электропорации.Это лучше понять при сравнении результатов электропорации для различных применений импульсов энергии.

Жизнеспособность клеток и эффективность электротрансфекции: постоянный поток заряда

Влияние состава буфера и приложенной энергии электрического импульса на жизнеспособность клеток и eTE исследовали в условиях, при которых поток заряда поддерживался постоянным (таблица 3). Рисунок 1 представляет собой график зависимости жизнеспособности клеток от приложенной электрической энергии для экспериментов с постоянным потоком заряда с использованием буферных растворов на основе Mg ²⁺ и K ⁺ при конечной проводимости 500 мкСм / см.Два отдельных двухфакторных дисперсионных анализа были выполнены для изучения влияния состава буфера и приложенной энергии импульса на жизнеспособность клеток. Первый анализ включает все буферные композиции при 500 мкСм / см. Анализ показал, что состав буфера, энергия импульса и порядковое взаимодействие между ними оказали значительное влияние на жизнеспособность клеток ( p <0,0001). Однако заметная разница в зависимости жизнеспособности от приложенной энергии для разных буферных составов показана на рис.1, с двумя наблюдаемыми различными ответами жизнеспособности клеток, т.е. линейным по сравнению с нелинейным распадом, для буферных композиций, содержащих Mg ²⁺ и не содержащих Mg ²⁺ , соответственно. Двусторонний дисперсионный анализ результатов только с буферными композициями, содержащими Mg ²⁺ (MgCl ₂ , MgCl ₂ / KCl, MgSO ₄ ), показал, что энергия импульса оказывает значительное влияние на жизнеспособность клеток ( p <0,0001), в то время как состав буфера и взаимодействие между переменными не являются значимыми, а апостериорный анализ не дает статистической значимости, достигаемой ни при каких импульсных условиях между составами буфера.Наглядное представление этого можно найти на дополнительном рис. 2. Это демонстрирует важность наличия Mg ²⁺ в буферной композиции для жизнеспособности клеток, расширяя диапазон обратимой электропорации для популяций клеток. Эти результаты согласуются с другими сообщениями, указывая на то, что Mg ²⁺ необходим для сохранения жизнеспособности клеток ^22,23 .

Жизнеспособность в зависимости от приложенной электроэнергии. Каждый буфер с конечной проводимостью 500 мкСм / см с Cl ^— в качестве аниона и сахарозой в качестве осмотического балансирующего агента.Буферы Mg ²⁺ и Mg ²⁺ / K ⁺ имели значительно более высокие результаты жизнеспособности ( p <0,05) по сравнению с буфером K ⁺ . Буферы, содержащие Mg ²⁺ , приводили к линейной реакции жизнеспособности, тогда как буфер K ⁺ приводили к кривой реакции экспоненциального спада жизнеспособности.

Хотя ионы Mg ²⁺ , по-видимому, сохраняют жизнеспособность клеток, добавление магния может значительно снизить eTE ^25,26 .При сравнении результатов для eTE буферы, содержащие Mg ²⁺ , приводят к более низким eTE по сравнению с таковыми для буферных растворов на основе K ⁺ (рис. 2). Аналогичным образом были выполнены два отдельных двухфакторного дисперсионного анализа для анализа данных 500 мкСм / см (буферы, содержащие Mg ²⁺ , и все буферы). Результаты двустороннего дисперсионного анализа при сравнении всех буферных растворов показывают, что энергия импульса ( p <0,0001), состав буфера ( p <0,0001) и взаимодействие между переменными ( p = 0.148, порядковый номер) все они оказывают значительное влияние на eTE. Отдельный анализ буферных композиций, содержащих только Mg ²⁺ , показывает, что приложенная энергия импульса и состав буфера значительно влияют на eTE ( p <0,0001), но взаимодействие между ними не является значительным. Апостериорные сравнения показали, что более высокие концентрации Mg ²⁺ отрицательно влияют на eTE. В частности, комбинированный буфер MgCl ₂ / KCl приводил к значительно более высоким eTE по сравнению с буферами, содержащими только MgCl ₂ и MgSO ₄ .В целом, эти результаты предполагают, что оптимальная концентрация Mg ²⁺ может быть определена для буфера электропорации, поскольку ион Mg ²⁺ играет главную и конкурирующую роль в жизнеспособности клеток и эффективности трансфекции.

Эффективность электротрансфекции в зависимости от приложенной электрической энергии. Каждый буфер с конечной проводимостью 500 мкСм / см с Cl ^— в качестве аниона и сахарозой в качестве осмотического балансирующего агента. Присутствие Mg ²⁺ приводит к более низким уровням eTE по сравнению с буфером на основе KCl, при этом более высокие концентрации Mg ²⁺ дополнительно усиливают этот наблюдаемый эффект.Линейное увеличение eTE наблюдалось с увеличением приложенной энергии во всех буферных композициях.

Роль магния во время электропорации

Эти результаты привели нас к гипотезе о том, что влияние Mg ²⁺ на жизнеспособность и eTE обусловлено взаимодействием между Mg ²⁺ и нуклеиновыми кислотами, ролью которого является Mg ²⁺ играет роль кофактора биохимических реакций или их комбинации. Mg ²⁺ является важным двухвалентным катионом, который необходим для активации многих клеточных ферментов.

Использование флуоресцентно меченных векторов pDNA, Haberl et al . сообщили об усилении взаимодействия между клеточной мембраной и пДНК с увеличением концентрации Mg ^{2+ 22} . Хотя они считают, что это необходимый шаг для трансфекции, возможно, это взаимодействие приводит к более низкому eTE, поскольку больше ДНК захватывается на поверхности мембраны и меньшее количество векторов проникает через мембрану во внутриклеточное пространство. Другой механизм, который может привести к снижению eTE, — это роль иона магния в качестве кофактора для биохимических реакций, в частности, активации ферментов ДНКазы и РНКазы, приводящей к деградации пДНК или транслируемой мРНК до синтеза белка ²⁷ .Эта гипотеза была ранее проверена посредством неспецифического ингибирования ферментов с использованием Zn ^{2+ 28} . Дельгадо-Канедо и др. . исследовали эффект добавления Zn ²⁺ к буферному раствору либо до электропорации, либо во время электропорации, либо сразу после электропорации. Они сообщили об увеличении eTE на 12% при добавлении Zn ²⁺ сразу после электропорации по сравнению с отсутствием добавления Zn ^{2+ 29} . Эту методологию повторили Хаберл и др. ., но не сообщалось об изменениях eTE в присутствии Zn ^{2+ 23} . Мы также повторили этот эксперимент и не обнаружили увеличения eTE ни в одном из трех условий нанесения Zn ²⁺ (данные не показаны). Невозможность воспроизвести этот эксперимент, вероятно, является результатом экспериментальной изменчивости, поскольку ингибирование зависит от времени нанесения Zn ²⁺ . Однако использование Zn ²⁺ привело к снижению жизнеспособности клеток, предположительно из-за ингибирования ионных каналов мембран-белков.

Ингибирование АТФазы

Под воздействием внешнего электрического поля высокой интенсивности во время электропорации нарушается внутриклеточный ионный гомеостаз, в результате чего жизнеспособность клеток зависит от восстановления этой гомеостатической среды ³⁰ , предположительно через натрий-калиевый ион АТФазы насос. Рольс и др. . продемонстрировали, что истощение АТФ в клетках СНО посредством инкубации в азиде натрия и 2-дезокси-D-глюкозе не влияло на эффективность пермеабилизации, но оказывало сильное влияние на жизнеспособность после электропорации ³¹ _. Помимо активации ферментов ДНКазы / РНКазы, Mg ²⁺ также необходим для активации переносчиков ионов АТФазы ^27,32 . Pilotelle-Bunner и др. . сообщили, что Mg ²⁺ обладает высокой аффинностью связывания ( K _d = 0,069 мМ) для этого фермента, при этом активность фермента достигает насыщения при ~ 1 мМ Mg ²⁺ . Эти переносчики белков отвечают за активный транспорт критических ионов (Na ⁺ , K ⁺ , Cl ^— и т. Д.)) через клеточную мембрану ³² . Следовательно, присутствие Mg ²⁺ в буферах электропорации может повысить жизнеспособность клеток за счет ускорения восстановления ионного гомеостаза даже при применении импульсов с более высокой энергией.

Чтобы предварительно проверить эту гипотезу, лидокаин, известный ингибитор ионных каналов АТФазы, был добавлен к буферным растворам для электропорации (KCl и MgCl ₂ при 500 мкСм / см) в конечной концентрации 10 мМ ^33,34,35 . Подали электрические импульсы с различной приложенной энергией, при этом жизнеспособность клеток оценивалась через 24 часа.Фигура 3 представляет собой график зависимости жизнеспособности клеток от приложенной электрической энергии для обоих буферов с добавлением лидокаина и без него. Как состав буфера (т.е. присутствие лидокаина), так и энергия импульса существенно влияют на жизнеспособность клеток. (Точные тесты и значения значимости см. В дополнительных таблицах 1 и 2). В случае буферов KCl добавление лидокаина приводило к снижению жизнеспособности клеток при применении более низкой энергии импульса, но это не влияло на статистическую значимость ответа жизнеспособности.Это говорит о том, что внутриклеточные запасы Mg ²⁺ позволяют восстанавливать клетки при применении импульсов с меньшей энергией. Более драматический эффект наблюдался при добавлении лидокаина к буферу MgCl ₂ . В этом случае при превышении порогового значения приложенной энергии наблюдалось резкое снижение кривой реакции жизнеспособности, напоминающее реакцию жизнеспособности буферного раствора на основе KCl. Эти данные предоставляют некоторые доказательства того, что активация АТФазы посредством связывания постороннего Mg ²⁺ необходима для сохранения жизнеспособности клеток после применения импульсов электропорации с высокой энергией, повышая устойчивость популяции клеток к электрической энергии, что приводит к обратимой электропорации.

Ингибирование мембранной АТФазы. Жизнеспособность клеток оценивали как для MgCl _2, , так и для KCl-буферов при 500 мкСм / см с добавлением лидокаина, ингибитора ионных каналов, в конечной концентрации 10 мМ. Обнаружена значительная разница в итоговой жизнеспособности клеток, когда лидокаин присутствует даже в присутствии Mg ²⁺ , наиболее заметно сдвиг кривой реакции жизнеспособности, напоминающий сдвиг в зависимости от буферной композиции на основе KCl.

Оценка результатов электропорации

Для изучения комбинированных эффектов жизнеспособности и eTE на результаты электропорации, когда необходимо получить как высокую жизнеспособность, так и высокую эффективность трансфекции, была создана система оценки (рис.4). Этот показатель является продуктом жизнеспособности клеток (% живых клеток) и процентов эффективности трансфекции (этих живых клеток,% трансфицированных / экспрессирующих GFP) с оценками в диапазоне от 0 у.е. до 100 а.е., для каждого экспериментального условия, как показано на рис. 4. Этот показатель позволяет различать как различные буферные растворы, так и импульсные приложения в исследовании. В наших результатах мы обнаруживаем существование трех различных регионов: высокая жизнеспособность с низким eTE (1), низкая жизнеспособность с высоким eTE (2) и жизнеспособность от умеренной до высокой с умеренным eTE (3).Группа высокой жизнеспособности с низким значением eTE (1) состоит из всех буферных растворов для импульсных приложений с более низкой энергией и буферов, содержащих Mg ²⁺ , для приложений с более высокими импульсами. Вероятно, что в этой области проницаемо было мало клеток, что привело к низким результатам трансфекции. Группа с низкой жизнеспособностью / высоким eTE (2) состоит из буферов, в которых отсутствует Mg ²⁺ для высокоэнергетических импульсных приложений. Следовательно, клетки, суспендированные в буфере на основе KCl, которые остаются жизнеспособными после импульсов высокой энергии, вероятно, будут успешно трансфицированы.Клетки в этой группе предположительно чрезмерно проницаемы и не могут восстанавливаться, что приводит к более низким результатам жизнеспособности. Последняя группа, которую мы считаем оптимальной в соответствии с нашей метрикой, — это жизнеспособность от умеренной до высокой / умеренная ЭТЭ (3). Эта область результатов является результатом того, что большинство клеток претерпевают обратимую электропорацию, поглощают и транскрибируют пДНК, выживая при этом в общем процессе электропорации. Эта группа в основном состоит из буфера KCl при 500 мкСм / см для импульсных применений с низкой и средней энергией и буфера смеси MgCl ₂ / KCl при 500 мкСм / см для всех импульсных применений, при этом буфер смеси дает максимальную результаты оценки.Эти данные дополнительно демонстрируют преимущества включения оптимального количества Mg ²⁺ в буфер электропорации. Самый высокий результат электропорации составил 52 у.е. (MgCl ₂ / KCl, 2,4 кВ / см: 500 мкс, жизнеспособность — 93%, eTE — 56%), демонстрируя значительные возможности для улучшения, особенно в eTE. Недавние работы продемонстрировали и отметили важную роль эндоцитотических путей в успешных результатах электротрансфекции, в частности, ингибирующий эффект длительных низких температур на клетки после применения импульса электропорации ^26,36,37,38 .Принимая это во внимание, исключив короткий период инкубации на льду после электропорации, можно было ожидать улучшения результатов электропорации. Тем не менее, эти результаты предоставляют важную информацию и методологию для демонстрации количественного сравнения между различными эффектами, которые выбранные буферные композиции оказывают на результаты электропорации, и тем самым позволяют рационально разработать буферную композицию для электропорации. В частности, результаты подчеркивают необходимость оптимизации концентрации ионов Mg ²⁺ для повышения жизнеспособности клеток и результатов eTE, что согласуется с другими отчетами ²⁶ .Использование этих результатов в тандеме с оптимизацией других переменных увеличит баллы результатов электропорации, что приведет к дальнейшему принятию электропорации в качестве метода для выполнения клинически значимых трансфекций клеток.

Оценка результатов электропорации. Цветовой код буфера: синий — MgCl ₂ (500 мкСм / см), красный — KCl (500 мкСм / см), голубой — MgCl ₂ (2000 мкСм / см), пурпурный — KCl (2000 мкСм / см), белый — MgCl ₂ / KCl (500 мкСм / см), зеленый — MgSO ₄ (500 мкСм / см), желтый — KCl с трегалозой (500 мкСм / см).Код применения импульса: * — управляющий импульс (1,2 кВ / см: 1 мс), ◊ — постоянная приложенная энергия, Δ — 1,8 кВ / см: 670 мкс, × — 2,4 кВ / см: 500 мкс, ○ — 3,6 кВ / см: 330 мкс, + — 4,8 кВ / см: 250 мкс. Область 1 представляет высокую жизнеспособность с низким eTE и состоит из буферов Mg ²⁺ (+) и / или применения импульсов с низкой энергией. Область 2 представляет низкую жизнеспособность с высоким eTE и состоит из Mg ²⁺ (-) и / или высокоэнергетических импульсных приложений. Область 3 имеет жизнеспособность от умеренной до высокой с умеренным eTE и состоит из Mg ²⁺ (-) в импульсных приложениях с низкой энергией и Mg ²⁺ (+) в импульсных приложениях с более высокой энергией, с Mg ²⁺ / K ⁺ -буфер, приводящий к лучшим результатам.

Будущая работа

Мы ожидаем, что подход, использованный при разработке этих исследований, может быть расширен за счет включения других буферных композиций и типов клеток (т.е. PBMC, клеток Jurkat, клеток HEK293T и т. Д.). Это поможет разработать оптимизированные протоколы электропорации для конкретных приложений, таких как редактирование генов, генерация CAR Т-клеток и т. Д. Однако каждый буфер электропорации (т.е. среды для культивирования клеток, фосфатно-солевой буфер и другие буферы на основе фосфатов) ) и тип соты могут дать различную жизнеспособность и eTE для данного приложения и должны рассматриваться как продвижение вперед.Мы также хотим дополнительно изучить нашу гипотезу о том, что влияние магния на жизнеспособность после электропорации и eTE связано с ролью магния как кофактора в биохимических процессах. Мы считаем, что систематическое изменение состава буфера в сочетании с поддержанием постоянной энергии импульса и общего потока заряда представляет собой улучшенный подход к определению оптимизированных протоколов электропорации в таком большом пространстве экспериментальных параметров.

Молекулярные основы электропорации | BMC Biochemistry

Моделирование дает графическое представление о процессе порообразования, но почему поры образуются вообще?

Система вода / октан простейшая: внешнее поле взаимодействует только с молекулами воды, так как модель, используемая для октана, не имеет зарядов.В объемной воде и в отсутствие соли приложенное поле просто вызывает небольшую среднюю ориентацию, описываемую функцией Ланжевена, с небольшим влиянием на свойства воды, поэтому мы сосредоточимся на границе октан / вода. Граница раздела вода / октан составляет всего несколько десятых долей нм в ширину, но поскольку молекулы воды ориентируются на этой границе, плотность заряда вдоль оси z неоднородна, даже в отсутствие приложенного поля (рис. 4A). Интересно отметить, что характеристики чистого распределения заряда очень похожи для воды / октана, воды / фосфолипида и воды / фосфолипида / соли, несмотря на большую разницу в молекулярной структуре октана и липида и потенциально большой эффект 1 М NaCl (рис. 4А).

A) Плотность заряда, B) электрическое поле и C) электростатический потенциал для воды / октана при четырех различных значениях приложенного поля (слева) и липидном бислое без соли для трех различных значений приложенного поля. и с солью при нулевом приложенном поле (справа). Свойства на этом рисунке и на рисунках 4 и 5 были рассчитаны на основе моделирования, в котором поры не образовывались, иначе усреднение в зависимости от координаты z было бы невозможно.

Для взаимодействия с электрическими полями молекулы воды можно представить как диполь.Сила, действующая на диполь, равна F = ( μ • ∇) E и равна нулю в постоянном поле. Интересна составляющая силы вдоль нормали бислоя (ось z):. Здесь она пропорциональна плотности заряда ρ ( z ), которую можно рассчитать непосредственно из моделирования. На рисунке 5A показан градиент локального электрического поля, выраженный как сила, действующая на диполь, ориентированный вдоль оси Z, с величиной 1 D (дипольный момент используемой модели SPC равен 2.27 D).

Межфазные свойства границ раздела вода / октан (слева) и вода / фосфолипид (справа) в зависимости от приложенного внешнего поля. Показаны (A) сила, действующая на гипотетический диполь с силой 1 D, направленный в направлении оси Z, (B) средняя ориентация молекул воды вдоль оси Z, выраженная как величина дипольного момента. в Дебая по оси Z, (C) средняя сила в z-направлении, рассчитанная из произведения средней ориентации и градиента поля, и (D) профиль плотности для общей плотности и компонентов воды или фосфолипидов. по оси Z.При моделировании октанового числа показанные данные были усреднены по траектории от 5 до 50 нс без образования пор. В моделировании фосфолипидов данные усреднялись за 0–20 нс для 0 M / 0 В (который уже был уравновешен в этих условиях), 10–20 нс для 0 M / 0,083 В и 20–50 нс для 0 M / 0,33. V.

Этот градиент зависит от силы приложенного поля и с левой стороны увеличивается по мере того, как приложенное поле становится сильнее.

Без приложенного поля локальное поле быстро меняет направление на границе с примерно равными величинами.В присутствии приложенного внешнего поля, как в экспериментах по электропорации, градиент локального поля больше не является симметричным для обеих границ раздела. С одной стороны, градиент поля увеличивается с увеличением внешнего потенциала, с другой — уменьшается. Чтобы усилить эффект увеличенного градиента на стороне положительного потенциала, молекулы воды становятся сильно ориентированными в присутствии внешнего поля, так что как проецируемый дипольный момент в Z-направлении, так и градиент поля, заставляющий эти диполи в мембрану, становиться больше. (Рисунок 5B), и, в зависимости от точного местоположения, средняя сила из-за градиента поля, действующего на водяные диполи (Рисунок 5C).Для ориентации также показаны профили плотности, показывающие плотность различных частей системы как функцию Z (рис. 5D).

Локальные колебания и водородные связи облегчают процесс введения; водородная связь в гидрофобной внутренней части сильнее, чем в воде, так что вероятность роста дефекта существенно больше, чем вероятность первоначального образования дефекта. Если градиент поля является движущей силой для образования дефектов воды, следует ожидать, что образование дефектов с обеих сторон не одинаково вероятно, потому что градиенты поля не симметричны.

Действительно, образование пор в простой системе вода / октан имеет гораздо более высокую вероятность инициирования с положительной стороны. В 100 моделированиях вода / октан с приложенным полем 0,8 В / нм порообразование происходило более 90 раз с положительной стороны, в то время как в остальных случаях существенные дефекты с обеих сторон объединились, чтобы сформировать начальный единичный водный дефект, охватывающий октановую фазу. . Это согласуется с небольшой силой на правой стороне (высокий Z) моделирования октан / вода 0,5 В / нм.

Для липидных бислоев силы более симметричны, и действительно, в небольшом количестве событий порообразования, наблюдаемые дефекты воды с обеих сторон играют роль. Влияние внешнего поля на ориентацию воды в бислоях аналогично по сравнению с октаном. С положительной стороны, поле вызывает значительное увеличение упорядочения воды с тем же направлением, что и в отношении вода / октановое число, несмотря на «дополнительный» отрицательный пик на уровне прибл. 3 нм. С отрицательной стороны, внешнее поле упорядочивает молекулы воды в направлении, противоположном направлению границы раздела, и средняя степень ориентации уменьшается.Фактически, в области с плотностью воды менее 10% от объемной плотности, ориентация воды меняется на противоположную в более высоких полях по сравнению с нулевым полем.

График плотности различных групп (липидов, воды, ионов, а также групп атомов в липидах) показывает, что расстояние от пика до пика профиля плотности липидов не изменяется, но отдельные группы становятся шире, и вода проникает несколько глубже в мембрану (рис. 6). Это согласуется с экспериментальными данными, которые показывают, что емкость бислоя существенно не уменьшается в присутствии внешней разности потенциалов, указывая на то, что бислой не становится значительно тоньше [1].Расширение распределения воды по направлению к внутренней части мембраны, даже несмотря на то, что абсолютная плотность воды во внутреннем углеводородном пространстве остается очень низкой, все же показывает значительно уменьшенный барьер для проникновения воды. Это согласуется с изменением потенциала средней силы для воды, движущейся к гидрофобной внутренней части. Усредненная полная сила, действующая на молекулы воды F _ave (z), связана с потенциалом средней силы для воды, движущейся из объема воды в гидрофобную фазу, как минус производная потенциала средней силы [16].Средняя полная сила становится менее отрицательной на положительной стороне, так что потенциал средней силы действительно становится менее крутым с приложенным полем.

Профиль плотности, сравнивающий распределение воды, липидов и элементов головных липидных групп в моделировании без внешнего поля (сплошные линии, усредненные за 0–20 нс) и с внешним полем 0,33 В / нм (штриховые линии, усредненные за 20–50 нс). Черный — это общая плотность, плотность зеленой воды, плотность красных липидов, плотность желтого фосфата, плотность синего холина и плотность коричневого глицерина.

Хотя основная цель этой статьи — ответить на вопрос, почему образуются поры, моделирование дает интересные предположения относительно нескольких экспериментальных наблюдений и гипотез.

Во-первых, ДНК можно транспортировать в клетки путем электропорации их мембран. Молекулярная основа этого процесса противоречива; в настоящее время, по-видимому, существуют две основные гипотезы, без критических экспериментов для выбора между ними. В первом случае ДНК транспортируется через большие стабильные поры, которые образуются без значительного взаимодействия с ДНК, а затем повторно запечатываются.Недавняя теоретическая модель поддерживает эту идею [17]. Вторая, более широко поддерживаемая гипотеза предполагает, что ДНК транспортируется в клетки путем прямого взаимодействия с липидами и промежуточными продуктами, которые включают комплекс липидных компонентов и ДНК. В этом случае проницаемость электрическим полем может вызвать ряд более мелких пор, которые сами по себе недостаточно велики, чтобы обеспечить транспорт ДНК, но делают мембрану поддающейся структурным модификациям, которые позволяют транслокацию ДНК [4, 18, 19].Моделирование большого бислоя дает отверстия диаметром до 10 нм, которые были бы достаточно большими, чтобы обеспечить транспортировку двухцепочечной ДНК. Однако это не окончательный ответ, потому что электрическое поле в присутствии пор может быть выше, чем может быть достигнуто в реальных экспериментах с ячейками (см. Ниже), и еще предстоит показать, что поры такого размера обратимы и будут повторно запечатываться. когда электрическое поле снято. Недавнее исследование молекулярной динамики Leontiadou et al.исследовал стабильность малых пор в бислоев и установил минимальный радиус, при котором гидрофильные поры в бислое дипальмитоилфосфатидилхолина могут быть стабильными [20], но максимальный радиус, насколько мне известно, не известен, хотя недавняя модель предполагает, что он может быть довольно большим [17] ].

Моделирование также предлагает объяснение экспериментальных наблюдений, согласно которым заряд липидной головной группы и ионная сила раствора, по-видимому, мало влияют на электропорацию, но что липидные хвосты, холестерин и гидрофобные полимеры действительно имеют значительное влияние [21–23].Во-первых, моделирование предполагает, что солевой эффект практически отсутствует, поскольку вклады этих зарядов в локальные градиенты поля на границе раздела практически нейтрализуются. Хотя электропорация в бислоях с липидами с заряженными головными группами не моделировалась, это было бы интересным расширением. Важным вкладом, по-видимому, является дополнительный эффект внешнего поля на границе раздела, независимо от точного состава интерфейса. Во-вторых, можно ожидать, что изменения в гидрофобной части мембраны (например,грамм. изменение липидных хвостов с пальмитоил-олеоила на дифитаноил или добавление холестерина) имеют значительный эффект, поскольку сила, необходимая для перемещения воды во внутреннюю гидрофобную среду, будет изменяться. Для липидов, которые более плотно упакованы, образование дефектов воды, вероятно, будет менее благоприятным. Для более длинных липидов можно также ожидать, что образование водных дефектов, охватывающих бислой, менее вероятно. Для липидных бислоев со структурными дефектами, например, вызванными поверхностно-активными веществами, можно было бы ожидать, что электропорация будет более легкой, потому что вода более благоприятна для проникновения.Эти гипотезы можно проверить как экспериментально, так и в дальнейшем моделировании. Моделирование также показывает, почему покрытие внешней стороны бислоев полимерами может увеличивать сопротивление порообразованию: водные дефекты все еще формируются, но следующие стадии, на которых головные группы липидов перемещаются, чтобы сформировать более стабильные поры, выстилаемые головными группами, нарушаются [24].

Интересное и экспериментально полезное наблюдение состоит в том, что электропроницаемые пузырьки и клетки более склонны к слиянию [9]. Настоящее моделирование предлагает ряд возможных объяснений этого, включая более высокую кривизну этих везикул (аналогичную большому бислою), метастабильную природу пор слияния и увеличенную площадь гидрофобной поверхности везикул с электропроницаемостью, которая будет способствовать слиянию.Слияние трудно изучать непосредственно во всех атомистических деталях, но недавно разработанные крупнозернистые модели фосфолипидов были использованы для исследования слияния между везикулами, а также могут быть использованы для проверки этих гипотез [25, 26].

Хотя моделирование, представленное здесь, дает беспрецедентную атомистическую детализацию процесса порообразования, они страдают несколькими ограничениями. Сюда входят как относительно очевидные ограничения на размер системы моделирования и длительность моделирования, так и более тонкие вопросы по сравнению с экспериментальными данными.

Самый крупный смоделированный бислой первоначально составляет ок. 25 × 29 нм в плоскости мембраны, но размер по оси z намного короче, изначально всего 8 нм. По мере образования пор бислой деформируется и «складывается» (рис. 1). На это складывание влияют периодические граничные условия, поскольку они допускают независимые изменения x и y, плоскости мембраны. Хотя это наиболее реалистичный выбор граничных условий, и на величину, и на форму структурных колебаний влияет требование, чтобы кривизна на границах была непрерывной с каждой стороны коробки.Также возможно масштабировать x и y вместе. Это сохранит форму бислоя и сделает невозможным экстремальное искривление, наблюдаемое в настоящем моделировании, хотя и допустит искривление в виде «ямочки».

Важный вопрос — какому типу экспериментов соответствует моделирование с точки зрения включения электрического поля. Напряжение в моделировании поддерживается на постоянном значении длины коробки, умноженной на приложенное поле, независимо от того, присутствует ли пора или нет.Моделирование предполагает, что потенциал повсюду в системе из-за приложенного постоянного поля такой же, как потенциал, вызванный электродами на большом расстоянии от мембраны в эксперименте с черной липидной мембраной. Рисунок 4 показывает, что это разумно для случая без пор, но распределение потенциала внутри пор слишком шумно, чтобы точно рассчитать на основе моделирования для подробного сравнения с континуальной электростатической моделью. Тем не менее, эксперименты в условиях фиксации напряжения измеряют ток как функцию времени и показывают скачок проводимости при образовании пор, но могут поддерживать исходное напряжение в присутствии пор до тех пор, пока мембрана не разорвется.В качестве альтернативы измерения можно проводить в условиях постоянного тока, отслеживая колебания напряжения. Интересный вопрос, который выходит за рамки этого исследования, заключается в том, как эксперименты на плоском липидном бислое соотносятся с экспериментами по электропорации на целых клетках. Исследование Hibino et al. показали, что мембранный потенциал имеет максимальное значение, предположительно потому, что большие поры рассеивают трансмембранный потенциал в растворах цельной клетки [27].

Экспериментально критическое напряжение, которое вызывает порообразование в черной липидной мембране, составляет порядка 0.25–0,50 В. В случае приложенного поля 0,4 В / нм полная разность потенциалов на мембране составляет примерно 3 В, или в 5–10 раз больше. Тем не менее, порообразование может быть вызвано гораздо более высокими полями при моделировании, при этом сохраняя те же характеристики, хотя и в более быстром масштабе времени. Экспериментально срок службы черной липидной мембраны короче при приложении более сильного напряжения, но индивидуальные свойства пор не зависят от приложенного напряжения [11]. Вероятно, образование пор при моделировании при более низких разностях потенциалов будет происходить медленнее, но все равно будет происходить.При таком моделировании невозможно определить критическое напряжение.

Точного соответствия во временных масштабах между моделированием и экспериментом нельзя ожидать из-за небольшого размера моделирующей мембраны по сравнению с экспериментом и экспериментальных временных масштабов из-за емкости мембраны и временного разрешения измерений [1]. Также невозможно предсказать распределение размеров пор или их пространственное распределение в большой мембране, хотя моделирование большого бислоя показывает, что поры могут находиться довольно близко друг к другу, не оказывая большого влияния друг на друга, по крайней мере, в течение наносекундного времени.